橡胶树多倍体诱导机制和途径

张源源　康向阳　李维国

摘 要 多倍体育种作为橡胶树育种的重要手段，曾引起育种工作者的广泛关注并进行了大量研究。本文从获得橡胶树多倍体的机制和途径方面总结前人的研究成果；讨论橡胶树多倍体育种面临的问题；提出橡胶树多倍体育种的研究方向，为橡胶树多倍体育种工作提供理论帮助。

关键词 橡胶树 ；多倍体 ；机制 ；途径

分类号 S335.1

橡胶树（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）在植物分类学上属于大戟科（Euphorbiaceae）橡胶树属（Hevea），被认为是一种双二倍体（2n=4x=36）植物[1]。橡胶树的次生代谢物质橡胶是制造轮胎等制品的重要原料，通过选育橡胶树新品种提高橡胶产量的重要性不言而喻。然而，当前橡胶树育种由于种种原因[2-3]而出现了停滞不前的局面。在云南广泛种植的橡胶树优良品种云研77-2和77-4被证明为三倍体[4]，表明多倍体橡胶树品种具有大幅度提高产量和抗性的潜力，为打破橡胶树育种的困境提供了一种新的思路。

多倍体育种作为林木育种的一种重要理论和方法，自20世纪70年代在橡胶树育种中有过短暂热潮后，一直处于低谷。本文通过讨论获得橡胶树多倍体的机制和途径，总结前人在橡胶树多倍体育种方面的研究成果，探讨橡胶树多倍体育种面临的问题和解决途径，希望能够引起橡胶树育种工作者对多倍体育种这一领域的重新关注，开辟橡胶树多倍体育种的新天地。

1 植物多倍体的特点

多倍体是指具有三套或三套以上完整染色体组的生物个体。多倍体植物存在广泛。据估计，大约30%～80%植物种中存在多倍体[5]。多倍体化在基因表达和发育过程中具有重要影响，可直接改变物种的形态、繁殖系统和生态适应性，是形成新物种的重要途径之一，是推动进化的重要力量[6]。

多倍体植物具有细胞体积大、个体高大、叶片宽厚、分枝数少、花果少、种子大、生长速度快、代谢速率高、次生代谢物质产量高、抗逆性和适应性强等特点[7-10]。在以获得生物产量为目标的生产应用中具有二倍体无可比拟的优势。多倍体育种具有产生杂种优势、获得基因冗余、打破自交不亲和壁垒、改变生殖系统的优点，是植物遗传育种的重要手段之一[11]。

多倍体有诸多的优点，但是多倍化导致的细胞结构改变、有丝分裂和减数分裂不稳定、易产生非整倍体、育性降低、改变基因表达调控、表观遗传不稳定等[11]，同样会影响到多倍体的利用。

2 植物产生多倍体的机制

开花植物产生多倍体的机制主要有体细胞染色体加倍和未减数配子（2n）发生2种[12-14]，这些机制同样适用于橡胶树。

2.1 体细胞染色体加倍

体细胞染色体加倍是在体细胞进行有丝分裂的过程中，通过物理（机械损伤、高低温、射线等）或化学（秋水仙碱、紫杉醇等）刺激，抑制纺锤丝活动，阻止染色体分向两极，从而获得染色体加倍的细胞或组织。植物孢子体的分生组织由于各种刺激常会产生染色体加倍的细胞，常发生于生长点、伤口或肿瘤部位，是新多倍体芽的来源。体细胞染色体加倍获得的均是偶数倍的多倍体，但是因为不是所有的组织或细胞均会产生加倍作用，因而常形成混倍体。体细胞染色体加倍还发生于合子细胞或者幼胚组织，形成整倍体。

2.2 未减数配子

未减数配子（2n）融合获得多倍体被认为是形成多倍体的最主要的途径[15]。2n配子主要通过大、小孢子发生时的“不减数”或者“减数分裂重组”产生。2n配子的产生机制主要有[16-17]：（1）孢原细胞有丝分裂失败，如发生内有丝分裂或双二倍化等；（2）染色体联会异常；（3）减数分裂缺失；（4）胞质提前分离；（5）胞质分离失败；（6）第二次减数分裂时形成平行染色体；（7）胞质分离异常形成多微核后融合等。所有机制按照其遗传效应可以分为第一次减数分裂复原（FDR，first division restitution）、第二次减数分裂复原（SDR，second division restitution）2种，分别可以遗传亲本约70%～80%、30%～40%的杂合性[18]。

3 获得橡胶树多倍体的途径

橡胶树作为世界范围内的重要经济树种，国外在20世纪40年代就开始了多倍体诱导研究[19]，国内在20世纪70年代也随之开始了相关研究。通过几十年的研究，已经可以通过不同途径获得多倍体植株。总结起来，可以分为自然选择和人工诱导两大途径。

3.1 直接选择和分离多倍体

直接从自然界选择和分离多倍体是获得多倍体植株最便捷的方法。目前，已经从自然界直接分离出了欧洲山杨[20]、桑树[21]、漆树[22]等三倍体植株，有的还应用到了生产中。

天然多倍体橡胶树同样存在，通过形态筛选和细胞学鉴定以及流式细胞检测等手段，是获得橡胶树多倍体的重要手段之一。胡东琼等[23]从橡胶树GT1的人工授粉苗、无性系种子实生苗和种子园实生苗中首次分离出了三倍体植株。紧接着，刘阳平[24]报道称于1970年发现了一株天然三倍体橡胶树。此后，鲜有天然多倍体橡胶树发现的报道。直到2009年，敖硕昌等[25]利用GT1×PR107自然杂交后代选育出的云研77-2和云研77-4被证实为多倍体，成为首例大面积应用于生产的橡胶树天然多倍体[4]。张源源[26]从橡胶树GT1的自然授粉种子中检测出3株天然三倍体，首次分析天然三倍体检出率为0.72%。

3.2 人工诱导获得多倍体

人工诱导获得多倍体是指通过物理方法（辐射、机械刺激、高低温等）和化学方法（秋水仙碱、紫杉醇、N2O[27]等）诱导体细胞染色体加倍或者生殖细胞不减数分裂，从而获得多倍体。人工诱导的对象多种多样，根据处理材料可以分为活体细胞、离体细胞和生殖细胞诱导等。此外，通过原生质体融合和胚乳培养同样可以获得多倍体。endprint

3.2.1 活体诱导

活体诱导主要是通过辐射、秋水仙碱等处理种子、生长点等，然后经过多代分离和芽接获得较为纯合的多倍体植株。这种途径方法简单，技术要求低，处理批量大，可直接从优良植株上获得多倍体。

橡胶树中主要通过种子、幼苗、顶芽诱导获得多倍体植株。国外研究方面，Luiz等[28]用秋水仙碱溶液处理橡胶树实生苗，获得了四倍体植株。马来西亚橡胶研究院（RRIM）普兰沙伯研究站于20世纪60年代用秋水仙碱处理橡胶树实生苗，获得了多倍体植株[29]。70年代，巴西农业研究所通过秋水仙碱处理诱导出了IAN870的多倍体植株[30]。印度橡胶研究所用秋水仙碱处理从GT1芽条的一个芽和无性系Tjir1的种子诱导出了多倍体植株[1，31-33]。

在国内，陆永林[34]从1974年开始用秋水仙碱溶液处理发芽的种子、种子幼芽和无性系顶芽，获得了一批多倍体植株。郑学勤等[35-36]于1980年首次报道用细胞学方法鉴定出了橡胶树多倍体植株。刘阳平[24]用不同浓度秋水仙碱溶液处理实生苗和无性系苗，获得了倍性稳定的多倍体植株。凌绪柏等[37]用秋水仙碱溶液处理无性系萌动芽，获得了稳定的多倍体。张树珍等[38]用浓度为1%的秋水仙碱溶液处理橡胶树无性系芽，诱导分理出了多倍体细胞达85%以上的多倍体无性系。从种子、幼苗和顶芽获得的多倍体大多是混倍体或嵌合体，经过多代分离后仍然难以获得完全纯合的多倍体，倍性优势难以发挥。因此，目前尚没有通过人工诱导得到的多倍体应用于生产的例子[39]。

3.2.2 离体诱导

离体诱导是相对于活体诱导的又一种体细胞诱导获得多倍体的方法。离体诱导可以直接获得纯合四倍体或者更高倍性体，克服了活体诱导产生混倍体的缺点，同时试验条件易于控制，结果重复性高，对于已经建立组织培养体系的植物，能够在短时间内诱导出大量多倍体植株。当前，橡胶树的组织培养技术尚不成熟，影响多倍体诱导的成功率，因而研究成果较少，只有曾宪松等[40]用0.5%的秋水仙碱处理二倍体植株的花药体细胞愈伤组织，诱导出了4株纯合四倍体植株。

3.2.3 未减数配子

未减数配子融合获得多倍体是形成多倍体的主要途径[15]。活体或离体细胞诱导获得主要是同源四倍体，而未减数配子杂交途径获得的是异源多倍体，同时具有倍性效应和杂合效应，具有更大的育种价值。

橡胶树育种工作者在人工诱导未减数配子方面做了初步的研究和尝试，获得了少量三倍体植株。郑学勤等[34]用秋水仙碱溶液处理橡胶树单核期雄花，然后采集成熟花粉用于授粉，获得了纯合三倍体。赖杭桂等[41-42]用秋水仙碱溶液处理橡胶树性器官，分别获得了未减数大小孢子，分别同二倍体植株授粉，初步认定获得了2株三倍体植株。其后，通过流式细胞仪检测确认获得的疑似植株为三倍体，并通过分子标记方法鉴定出了父母本[43]。

3.2.4 原生质体融合和胚乳培养

原生质体融合和胚乳培养是获得植物多倍体的两个重要途径。原生质体融合又称体细胞杂交，该技术的发展是建立在原生质体培养和组织培养的基础上的。首先，用纤维素酶和果胶酶处理植物细胞，得到无壁的原生质体，再通过化学或物理方法诱导异核体，进一步融合后成为共核体，经培养后诱导分化出同源或异源多倍体植株[44]。目前，通过原生质体培养已经得到橡胶树的愈伤组织[45]，获得再生植株[46-47]，为进行橡胶树原生质体融合获得多倍体打下了基础。

胚乳是由3个单倍体核融合而成的，1个单倍体核来自雄配子体，2个来自雌配子体，因此胚乳是天然的三倍体组织，具有双亲的遗传成分，对育种后代性状有一定的预见性。橡胶树种子具有丰富的胚乳，通过胚乳培养获得橡胶树三倍体植株是极有可能实现的[48]。目前尚没有进行橡胶树胚乳培养的相关研究。

3.2.5 倍性间杂交

在获得天然多倍体或者人工诱导多倍体后，通过不同倍性个体间杂交，可直接得到不同倍性的后代。例如四倍体同二倍体杂交获得三倍体，三倍体（极少数的）同二倍体杂交获得四倍体或三倍体，更高倍性间杂交获得更多倍性的后代。

人工诱导（主要是体细胞诱导）获得的多倍体橡胶树大多倍性不稳定，在生长过程中多倍性逐渐消失[49]。此外，橡胶树生长周期长，开花结实需要较长时间，在进行杂交时需要亲本具有较强的配合力，种种因素限制了橡胶树的倍性间杂交的研究。只有印度于1980年报道，用秋水仙碱诱导获得的四倍体植株同常规二倍体植株杂交，育成若干三倍体植株[19]。

4 橡胶树多倍体育种现状和前景展望

橡胶树多倍体育种自20世纪40年代开始以来，进行了大量的研究工作，在多倍体诱导技术方面取得了重要的研究进展。这些研究主要集中在体细胞染色体加倍方面，目前已经可以通过诱导枝条变异，然后截顶分离并且经过形态学、细胞学鉴定快速获得多倍体植株。尽管通过不同途径获得了大量多倍体植株，但是只有从自然授粉后代中直接选择出的三倍体云研77-2和云研77-4得到大面积生产应用。人工诱导橡胶树体细胞染色体加倍获得多倍体的研究工作最多，却至今没有成功应用于生产的报道，其原因可能是多倍体中基因杂合效应较倍性效应更为重要[50]，体细胞染色体加倍得到的多倍体在获得基因剂量效应的同时，减弱了基因杂合效应。

通过未减数配子杂交获得的多倍体可以获得基因剂量效应的同时不减弱基因杂合效应，是橡胶树多倍体育种最为行之有效的途径，但是此方面的研究较少。在进行人工诱导配子染色体加倍时，掌握树种的相关细胞遗传学知识可以取得事半功倍的效果[8]。橡胶树的大、小孢子发育过程等相关细胞学基础知识匮乏，影响了橡胶树未减数配子杂交进行多倍体育种研究的效果。另外，尽管获得大量橡胶树多倍体植株，却鲜有对其进行筛选和生产鉴定的后续报道。橡胶树在加倍后，由于基因重组、染色体重排，以及基因表达、表观遗传等变化的影响，不是所有多倍体的表现都优于二倍体，需要进一步进行选择和鉴定。后期需要的大量时间、人力物力投入，影响了橡胶树多倍体育种的发展。endprint

综上所述，人工诱导未减数配子应该是未来橡胶树多倍体育种研究的一条有效途径。立足于橡胶树生殖生物学研究[51-60]，突破人工诱导未减数配子的有效方法和处理时期等关键技术，在获得大量基因型不同的多倍体植株的基础上，根据“大群体、强选择”的育种策略，从中选择表现优良的多倍体植株进行无性系鉴定，从而选育出符合当前和未来橡胶树生产需要的新品种，丰富橡胶树种质资源，为我国橡胶生产提供品种支撑。

参考文献

[1] Markose V C. Colchiploid in Hevea brasiliensis[J]. Rubber Board Bulletin， 1975， 12（1）：3-5.

[2] 吴春太，李维国，高新生，等. 我国橡胶树育种面临的问题和对策[J]. 江西农业学报，2009，21（12）：74-77.

[3] 吴春太，李维国，高新生，等. 我国橡胶树育种目标及发展策略探讨[J]. 广西农业科学，2009，21（12）：1 633-1 636.

[4] 李惠波，周堂英，宁连云，等. 橡胶树新品种云研77-2和77-4的细胞学鉴定及育种过程[J]. 热带亚热带植物学报，2009，17（6）：602-605.

[5] Masterson J. Stomatal size in fossil plants：evidence for polyploidy in majority of angiosperms [J]. Science， 1994， 264： 421-23.

[6] Otto S P， Whittton J. Polyloid incidence and evolution [J]. Annu Rev Genet， 2000， 34： 401-437.

[7] Jackson RC. Evolution and systematic significance of polyploidy[J]. Annu Rev Ecol Syst， 1976， 7： 209-234.

[8] 康向阳. 林木多倍体育种研究进展[J]. 北京林业大学学报，2003，25（4）：70-74.

[9] Cavalier-Smith T. Nuclear volume control by nucleoskeletal DNA， selection for cell volume and cell growth rate，and the solution of the DNA C-value paradox[J]. J Cell Sci， 1978， 34： 247-278.

[10] 谭德冠，庄南生，黄华孙. 林木多倍体诱导的研究进展[J]. 华南热带农业大学学报，2005，11（1）：27-30.

[11] Luca Comai. The advantages and disadvantages of being polyploidy[J]. Nature Reviews Genetics，2005， 6： 836-846.

[12] Harlan R， Dewet J M J. On ō. Winge and a prayer：the origins of polyploidy[J]. The botanical review， 1975， 41（4）： 361-390.

[13] Justin Ramsey， Douglas W Schemske. Pathways， mechanisms， and rates of polyploid formation in flowering plants[J]. Annu Rev Ecol Syst， 1998， 29： 467-501.

[14] 曾正明，郭启高. 植物多倍体形成途径及机制[J]. 绵阳经济技术高等专科学校学报，2000，17（4）：1-4.

[15] Bretagnolle F， Thompson J D. Gametes with the somatic chromosome number：mechanisms of their formation and role in the evolution of autopolyploid plants[J]. New Phytol， 1995， 129： 1-22.

[16] Werner J E， Peloquin S J. Occurrence and mechanisms of 2 n egg formation in 2 x potato[J]. Genome， 1991， 34（6）： 975-982.

[17] Veilleux， R. Diploid and Polyploid Gametes in Crop Plants：Mechanisms of Formation and Utilization in Plant Breeding [J]. Plant breeding reviews John Wiley & Sons， Inc， 1985， 3： 253-288.

[18] 康向阳，王 君. 杨树多倍体诱导技术研究[M]. 北京：科学出版社，2010.

[19] 徐炳生. 三叶橡胶多倍体育种研究动态[J]. 热带作物科技，1982（3）：82-84.

[20] Nilsson-Ehle H. Note regarding the gigas form of Populus tremula found in nature[J]. Hereditas， 1936（21）： 372-382.endprint

[21] 杨新华，杨今后，罗承军. 桑树多倍体育种的回顾与展望[J]. 浙江农业科学，2000，6：304-308.

[22] 尚宗燕，李汝娟，张继祖. 三倍体漆树的细胞学研究[J]. 植物学报，1989，31（4）：253-258.

[23] 胡东琼，梁 茂，吴云通. 橡胶树自然多倍体的选择与分离的研究初报[J]. 热带作物研究，1982，3：1-5.

[24] 刘阳平. 诱导橡胶树多倍体研究[J]. 福建热作科技，1983，03：12-16.

[25] 敖硕昌，何丽岗，肖桂秀，等. 橡胶树高产抗寒材料云研77-2、云研77-4的选育[J]. 云南热作科技，1998，21（2）：3-8.

[26] 张源源. 橡胶树座果规律及三倍体诱导研究. 北京林业大学[D]. 北京：北京林业大学，2013.

[27] Satomi Kitamura， Masako Akutsu， Keiichi Okazaki. Mechanism of action of nitrous oxide gas applied as a polyploidizing agent during meiosis in lilies[J]. Sexual Plant Reproduction， 22（1）：9-14.

[28] Luiz O T， MENDES A J. Teixeira. Colchicine induced polyploidy of Hevea rubber plants[J]. Bragantia， 1963， 22（30）： 383-392.

[29] Shepherd H， Crisfield S B. Induction of polyploidy in Hevea brasiliensis[J]. Planter's Bulletin， 1969， 104： 248-256.

[30] Ong S H. Chromosome morphology at the pachytene stage in Hevea brasiliensis[J]. A preliminary report proceeding of international rubber conference， 1975 11： 3-12.

[31] Annual report of RRIM. Malaysia[C]. Kuala Lumpur：RRIM， 1970， p. 21.

[32] Annual report of RRIM. Malaysia[C]. Kuala Lumpur：RRIM， 1971， p. 29.

[33] Annual report of RRIM. Malaysia[C]. Kuala Lumpur：RRIM， 1973， p. 37.

[34] 陆永林. 诱导产生三叶橡胶多倍体植株的研究[J]. 遗传，1980，V2（6）：23-26.

[35] 郑学勤，曾宪松，陈向民，等. 诱导橡胶多倍体与其细胞学研究续报I[J]. 热带作物学报，1980，1（1）：27-31.

[36] 郑学勤，曾宪松，陈向民，等. 诱导橡胶多倍体与其细胞学研究续报II[J]. 热带作物学报，1981，2（1）：1-9.

[37] 凌绪柏，陈广盛，杨廷元. 提高橡胶树多倍体诱导率的方法研究[J]. 热带作物学报，1988，9（2）：1-9.

[38] 张树珍，郑学勤，曾宪松，等. 橡胶新种质多倍体的诱导及其研究[J]. 热带作物科技，1991，3：35-37.

[39] 谭德冠，黄华孙，庄南生. 橡胶树倍性育种研究进展[J]. 热带农业科学，2004，2（1）：58-64.

[40] 曾宪松，张树珍，张银东，等. 离体培养橡胶树体细胞诱导纯多倍性无性系方法的研究初报[J]. 热带作物学报，1997，18（2）：15-20.

[41] 赖杭桂，许少海，李临生，等. 巴西橡胶树性器官加倍技术的研究[J]. 热带作物学报，1998，19（4）：15-24.

[42] 赖杭桂，凌绪柏. 橡胶树花芽不同发育阶段秋水仙素诱导花序变异效果的研究[J]. 热带作物学报，1999，20（4）：6-10.

[43] 赖杭桂，陈 霞，徐洪伟等. 橡胶树三倍体种质创制及生物学鉴定[J]. 热带作物学报，2013，34（6）：1 001-1 006.

[44] 曾云中，左小明，吴雷昌. 原生质体电融合构建酵母多倍体的研究[J]. 微生物学报，1995，35（4）：264-270.

[45] 戴雪梅，华玉伟，李 哲，等. 橡胶树PR107原生质体的分离和培养研究[J]. 热带农业工程，2013，37（5）：1-4.

[46] 戴雪梅，黄天带，孙爱华，等. 橡胶树原生质体培养研究进展[J]. 热带作物学报，2011，32（10）：1 973-1 976.

[47] 戴雪梅，李哲，华玉伟等. 橡胶树热研8-79原生质体培养再生植株[J]. 南方农业学报，2013，44（12）：2 040-2 045.

[48] 谭德冠，孙雪飘，张家明. 巴西橡胶树的组织培养[J]. 植物生理学通讯，2005，41（5）：674-678.

[49] 黄有军，邱德勃，王哲魁，等. 橡胶树人工多倍体染色倍性研究[J]. 热带作物学报，2004（23）：7-14.

[50] Bingham E T. Maximizing heterozygosity in autopolyploids[M]. In： Lewis WH. Polyploidy： Biological Relevance. Now York： Plenum Press，1980， 471-489.

[51] 谢石文，邱德勃，郑坚端. 巴西橡胶树胚及胚乳发育的研究[J]. 热带作物学报，1981，2（2）：1-6.

[52] 赵淑娟. 橡胶树的花粉发育过程[J]. 热带作物学报，1985，6（1）：127-130.

[53] 赵淑娟. GT1花粉发育观察[J]. 热带作物学报，1985，6（2）：25-27.

（下转第58页）endprint