木薯清液发酵生产柠檬酸的工艺研究

汪磊

摘 要：以木薯清液为原料，用50L发酵罐进行柠檬酸发酵实验，接种量10～12%，发酵起始pH值控制为4.5～5.0，发酵温度37～39℃，罐压0.1Mpa，尿素添加量为0.6%，发酵68h产酸可达16.5%，残总糖≤1.0%，糖酸转化率≥98.1%。

关键词：木薯清液；柠檬酸；黑曲霉

玉米清液发酵生产柠檬酸已经被全国不少厂家所使用，该工艺克服了薯干、糖蜜等原料的一些弊端，为农副产品深加工找到了一条出路，但是对玉米需求量的增大会使全球粮食危机加重。木薯产量高，不与主要粮食争地，价格低廉，淀粉含量高，是取代玉米等原料生产柠檬酸的理想替代物，采用清液发酵具有发酵液固形物少，滤液清，油脂少，利于柠檬酸后提取，提高回收率和产品质量等特点。且液化后得到的滤渣可用于制备高品质的蛋白饲料。目前全国已有不少工厂以木薯粉为原料生产柠檬酸，文章进行了以木薯清液进行柠檬酸发酵的工艺研究。

1 材料与方法

1.1 菌种

黑曲霉（Aspergillus niger） 由中粮安徽生物化学有限公司菌种室提供。

1.2 培养基

斜面培养基：采用土豆琼脂培养基。

种子培养基：木薯液化清液，补充2%的玉米浆作为氮源。

发酵培养基：木薯液化清液，补充适量尿素作为氮源。

1.3 培养条件

斜面33℃，培养5～7d。种子罐采用5L单层平叶全自动发酵罐36℃培养20～24h，风量1：0.4vvm，转速300rpm，接入106个/ml的孢子。发酵罐采用50L三层平叶全自动发酵罐，装液量30L，风量1：0.2vvm，转速350rpm。

1.4 木薯液化清液的制备

按25%（m/v）的粉浆比对木薯粉进行调浆，按50U/g绝干淀粉的量加入耐高温α-淀粉酶，90℃液化至碘试合格，离心取清液。

1.5 分析方法

pH测定：采用pH计测定。

产酸测定：发酵液经普通滤纸过滤后，用0.1429mol/LNaOH滴定，每消耗1ml NaOH为1%酸度。

总糖测定：经6mol/L硫酸水解后，用费林法测定[1]。

还原糖测定：直接用费林法测定[1]。

蛋白质测定：用凯氏定氮法[2]。

2 结果与分析

2.1 接种量对木薯清液发酵柠檬酸产酸的影响

柠檬酸发酵接种量的多少，直接决定于进入培养系统的孢子数量[3]。菌丝球接种数一般与孢子数成正比。从表1中可以看出，菌丝球接种量大小对产酸率有一定的影响，在一定的范围内，接种量越大，产酸越高。但接种量过大会影响发酵的有效体积，本实验条件下，接种量在10～12%较为合适。

表1 接种量对产酸的影响

2.2 起始pH对木薯清液发酵柠檬酸产酸的影响

接种量10%，考察不同起始pH对玉米清液发酵的影响。从表2可以看出，pH值控制在4.5～5.0较为合适。起始pH较低（4.5以下），可能会影响糖化酶活力而使原料不能充分糖化。而pH值为大于5.5时，可能由于接近中性的条件下，细胞表面电荷减少，菌体间的斥力减弱而使菌球聚集，致使发酵产酸很慢[4]。

表2 起始pH对产酸的影响

2.3 发酵温度控制对木薯清液发酵柠檬酸的影响

从表3可以看出，温度低于35℃高于39℃时，菌体产酸水平较低。菌体最佳发酵温度为37～39℃。温度低于35℃时可能影响菌体生长从而导致产酸缓慢，发酵周期较长。温度高于39℃时，发酵周期虽然缩短，但转化率偏低，可能由于温度过高导致菌体及杂酸产生过量，菌体易早衰，影响糖酸转化率。

表3 不同发酵温度对产酸的影响

2.4 罐压控制对木薯清液发酵柠檬酸的影响

发酵罐通风时还要维持一定的罐压，在一定范围内，气体的溶解度与罐压成正比。从表4可以看出罐压在0.1Mpa时，平均每小时产酸可以达到0.25%，随着罐压的降低，产酸速率也在降低，当罐压降至0.02Mpa时，平均每小时产酸仅为0.08%。在柠檬酸发酵中，较高的罐压不仅增加菌体产酸所需的溶解氧，还可以增加二氧化碳的溶解度，促进二氧化碳的固定。

表4 不同罐压对产酸速率的影响

2.5 尿素的添加量对木薯清液发酵柠檬酸产酸的影响

发酵培养基中氮源含量过于丰富，菌生长代谢加快，虽对缩短发酵周期有利，但不利于柠檬酸积累，产酸率不高；但是氮源含量过少又不利于菌体生长发育[5]。本实验控制发酵起始pH5.0～5.5，发酵温度37～39℃，罐压0.1Mpa，接种量10%，以木薯清液为基料，加入不同量的尿素以调整发酵培养基的氮源含量，确定尿素的最适添加量。其产酸结果如图1所示。图1显示，尿素添加量在0.6%时产酸最高。尿素添加量低于此值，则氮源偏低而影响产酸，尿素添加量超过此值可能会对菌体产生一定的毒性从而影响菌体生长代谢。

表5 尿素添加量对产酸的影响

3 结束语

以木薯清液为原料，用50L发酵罐进行柠檬酸发酵实验，接种量10～12%，发酵起始pH值控制为4.5～5.0，发酵温度37～39℃，罐压0.1Mpa，尿素添加量为0.6%，发酵68h产酸可达16.5%（w/v），残总糖≤1.0%（w/v），糖酸转化率≥98.1%。

参考文献

[1]金其荣.有机酸发酵工艺学[M].北京： 中国轻工业出版社，1992.

[2]朱俭.生物化学实验[M].上海： 上海科学技术出版社， 1981.

[3]陈坚，堵国成，李寅，等.发酵工程实验技术[M].化学工业出版社， 2003： 70-71.

[4]陈燕飞.pH对微生物的影响[J].太原师范学院学报（自然科学版）， 2009（3）： 121-124.

[5]朱亨政.柠檬酸发酵[M].食品与发酵工业， 1994（06）： 69-74.endprint

摘 要：以木薯清液为原料，用50L发酵罐进行柠檬酸发酵实验，接种量10～12%，发酵起始pH值控制为4.5～5.0，发酵温度37～39℃，罐压0.1Mpa，尿素添加量为0.6%，发酵68h产酸可达16.5%，残总糖≤1.0%，糖酸转化率≥98.1%。

关键词：木薯清液；柠檬酸；黑曲霉

玉米清液发酵生产柠檬酸已经被全国不少厂家所使用，该工艺克服了薯干、糖蜜等原料的一些弊端，为农副产品深加工找到了一条出路，但是对玉米需求量的增大会使全球粮食危机加重。木薯产量高，不与主要粮食争地，价格低廉，淀粉含量高，是取代玉米等原料生产柠檬酸的理想替代物，采用清液发酵具有发酵液固形物少，滤液清，油脂少，利于柠檬酸后提取，提高回收率和产品质量等特点。且液化后得到的滤渣可用于制备高品质的蛋白饲料。目前全国已有不少工厂以木薯粉为原料生产柠檬酸，文章进行了以木薯清液进行柠檬酸发酵的工艺研究。

1 材料与方法

1.1 菌种

黑曲霉（Aspergillus niger） 由中粮安徽生物化学有限公司菌种室提供。

1.2 培养基

斜面培养基：采用土豆琼脂培养基。

种子培养基：木薯液化清液，补充2%的玉米浆作为氮源。

发酵培养基：木薯液化清液，补充适量尿素作为氮源。

1.3 培养条件

斜面33℃，培养5～7d。种子罐采用5L单层平叶全自动发酵罐36℃培养20～24h，风量1：0.4vvm，转速300rpm，接入106个/ml的孢子。发酵罐采用50L三层平叶全自动发酵罐，装液量30L，风量1：0.2vvm，转速350rpm。

1.4 木薯液化清液的制备

按25%（m/v）的粉浆比对木薯粉进行调浆，按50U/g绝干淀粉的量加入耐高温α-淀粉酶，90℃液化至碘试合格，离心取清液。

1.5 分析方法

pH测定：采用pH计测定。

产酸测定：发酵液经普通滤纸过滤后，用0.1429mol/LNaOH滴定，每消耗1ml NaOH为1%酸度。

总糖测定：经6mol/L硫酸水解后，用费林法测定[1]。

还原糖测定：直接用费林法测定[1]。

蛋白质测定：用凯氏定氮法[2]。

2 结果与分析

2.1 接种量对木薯清液发酵柠檬酸产酸的影响

柠檬酸发酵接种量的多少，直接决定于进入培养系统的孢子数量[3]。菌丝球接种数一般与孢子数成正比。从表1中可以看出，菌丝球接种量大小对产酸率有一定的影响，在一定的范围内，接种量越大，产酸越高。但接种量过大会影响发酵的有效体积，本实验条件下，接种量在10～12%较为合适。

表1 接种量对产酸的影响

2.2 起始pH对木薯清液发酵柠檬酸产酸的影响

接种量10%，考察不同起始pH对玉米清液发酵的影响。从表2可以看出，pH值控制在4.5～5.0较为合适。起始pH较低（4.5以下），可能会影响糖化酶活力而使原料不能充分糖化。而pH值为大于5.5时，可能由于接近中性的条件下，细胞表面电荷减少，菌体间的斥力减弱而使菌球聚集，致使发酵产酸很慢[4]。

表2 起始pH对产酸的影响

2.3 发酵温度控制对木薯清液发酵柠檬酸的影响

从表3可以看出，温度低于35℃高于39℃时，菌体产酸水平较低。菌体最佳发酵温度为37～39℃。温度低于35℃时可能影响菌体生长从而导致产酸缓慢，发酵周期较长。温度高于39℃时，发酵周期虽然缩短，但转化率偏低，可能由于温度过高导致菌体及杂酸产生过量，菌体易早衰，影响糖酸转化率。

表3 不同发酵温度对产酸的影响

2.4 罐压控制对木薯清液发酵柠檬酸的影响

发酵罐通风时还要维持一定的罐压，在一定范围内，气体的溶解度与罐压成正比。从表4可以看出罐压在0.1Mpa时，平均每小时产酸可以达到0.25%，随着罐压的降低，产酸速率也在降低，当罐压降至0.02Mpa时，平均每小时产酸仅为0.08%。在柠檬酸发酵中，较高的罐压不仅增加菌体产酸所需的溶解氧，还可以增加二氧化碳的溶解度，促进二氧化碳的固定。

表4 不同罐压对产酸速率的影响

2.5 尿素的添加量对木薯清液发酵柠檬酸产酸的影响

发酵培养基中氮源含量过于丰富，菌生长代谢加快，虽对缩短发酵周期有利，但不利于柠檬酸积累，产酸率不高；但是氮源含量过少又不利于菌体生长发育[5]。本实验控制发酵起始pH5.0～5.5，发酵温度37～39℃，罐压0.1Mpa，接种量10%，以木薯清液为基料，加入不同量的尿素以调整发酵培养基的氮源含量，确定尿素的最适添加量。其产酸结果如图1所示。图1显示，尿素添加量在0.6%时产酸最高。尿素添加量低于此值，则氮源偏低而影响产酸，尿素添加量超过此值可能会对菌体产生一定的毒性从而影响菌体生长代谢。

表5 尿素添加量对产酸的影响

3 结束语

以木薯清液为原料，用50L发酵罐进行柠檬酸发酵实验，接种量10～12%，发酵起始pH值控制为4.5～5.0，发酵温度37～39℃，罐压0.1Mpa，尿素添加量为0.6%，发酵68h产酸可达16.5%（w/v），残总糖≤1.0%（w/v），糖酸转化率≥98.1%。

参考文献

[1]金其荣.有机酸发酵工艺学[M].北京： 中国轻工业出版社，1992.

[2]朱俭.生物化学实验[M].上海： 上海科学技术出版社， 1981.

[3]陈坚，堵国成，李寅，等.发酵工程实验技术[M].化学工业出版社， 2003： 70-71.

[4]陈燕飞.pH对微生物的影响[J].太原师范学院学报（自然科学版）， 2009（3）： 121-124.

[5]朱亨政.柠檬酸发酵[M].食品与发酵工业， 1994（06）： 69-74.endprint

摘 要：以木薯清液为原料，用50L发酵罐进行柠檬酸发酵实验，接种量10～12%，发酵起始pH值控制为4.5～5.0，发酵温度37～39℃，罐压0.1Mpa，尿素添加量为0.6%，发酵68h产酸可达16.5%，残总糖≤1.0%，糖酸转化率≥98.1%。

关键词：木薯清液；柠檬酸；黑曲霉

玉米清液发酵生产柠檬酸已经被全国不少厂家所使用，该工艺克服了薯干、糖蜜等原料的一些弊端，为农副产品深加工找到了一条出路，但是对玉米需求量的增大会使全球粮食危机加重。木薯产量高，不与主要粮食争地，价格低廉，淀粉含量高，是取代玉米等原料生产柠檬酸的理想替代物，采用清液发酵具有发酵液固形物少，滤液清，油脂少，利于柠檬酸后提取，提高回收率和产品质量等特点。且液化后得到的滤渣可用于制备高品质的蛋白饲料。目前全国已有不少工厂以木薯粉为原料生产柠檬酸，文章进行了以木薯清液进行柠檬酸发酵的工艺研究。

1 材料与方法

1.1 菌种

黑曲霉（Aspergillus niger） 由中粮安徽生物化学有限公司菌种室提供。

1.2 培养基

斜面培养基：采用土豆琼脂培养基。

种子培养基：木薯液化清液，补充2%的玉米浆作为氮源。

发酵培养基：木薯液化清液，补充适量尿素作为氮源。

1.3 培养条件

斜面33℃，培养5～7d。种子罐采用5L单层平叶全自动发酵罐36℃培养20～24h，风量1：0.4vvm，转速300rpm，接入106个/ml的孢子。发酵罐采用50L三层平叶全自动发酵罐，装液量30L，风量1：0.2vvm，转速350rpm。

1.4 木薯液化清液的制备

按25%（m/v）的粉浆比对木薯粉进行调浆，按50U/g绝干淀粉的量加入耐高温α-淀粉酶，90℃液化至碘试合格，离心取清液。

1.5 分析方法

pH测定：采用pH计测定。

产酸测定：发酵液经普通滤纸过滤后，用0.1429mol/LNaOH滴定，每消耗1ml NaOH为1%酸度。

总糖测定：经6mol/L硫酸水解后，用费林法测定[1]。

还原糖测定：直接用费林法测定[1]。

蛋白质测定：用凯氏定氮法[2]。

2 结果与分析

2.1 接种量对木薯清液发酵柠檬酸产酸的影响

柠檬酸发酵接种量的多少，直接决定于进入培养系统的孢子数量[3]。菌丝球接种数一般与孢子数成正比。从表1中可以看出，菌丝球接种量大小对产酸率有一定的影响，在一定的范围内，接种量越大，产酸越高。但接种量过大会影响发酵的有效体积，本实验条件下，接种量在10～12%较为合适。

表1 接种量对产酸的影响

2.2 起始pH对木薯清液发酵柠檬酸产酸的影响

接种量10%，考察不同起始pH对玉米清液发酵的影响。从表2可以看出，pH值控制在4.5～5.0较为合适。起始pH较低（4.5以下），可能会影响糖化酶活力而使原料不能充分糖化。而pH值为大于5.5时，可能由于接近中性的条件下，细胞表面电荷减少，菌体间的斥力减弱而使菌球聚集，致使发酵产酸很慢[4]。

表2 起始pH对产酸的影响

2.3 发酵温度控制对木薯清液发酵柠檬酸的影响

从表3可以看出，温度低于35℃高于39℃时，菌体产酸水平较低。菌体最佳发酵温度为37～39℃。温度低于35℃时可能影响菌体生长从而导致产酸缓慢，发酵周期较长。温度高于39℃时，发酵周期虽然缩短，但转化率偏低，可能由于温度过高导致菌体及杂酸产生过量，菌体易早衰，影响糖酸转化率。

表3 不同发酵温度对产酸的影响

2.4 罐压控制对木薯清液发酵柠檬酸的影响

发酵罐通风时还要维持一定的罐压，在一定范围内，气体的溶解度与罐压成正比。从表4可以看出罐压在0.1Mpa时，平均每小时产酸可以达到0.25%，随着罐压的降低，产酸速率也在降低，当罐压降至0.02Mpa时，平均每小时产酸仅为0.08%。在柠檬酸发酵中，较高的罐压不仅增加菌体产酸所需的溶解氧，还可以增加二氧化碳的溶解度，促进二氧化碳的固定。

表4 不同罐压对产酸速率的影响

2.5 尿素的添加量对木薯清液发酵柠檬酸产酸的影响

发酵培养基中氮源含量过于丰富，菌生长代谢加快，虽对缩短发酵周期有利，但不利于柠檬酸积累，产酸率不高；但是氮源含量过少又不利于菌体生长发育[5]。本实验控制发酵起始pH5.0～5.5，发酵温度37～39℃，罐压0.1Mpa，接种量10%，以木薯清液为基料，加入不同量的尿素以调整发酵培养基的氮源含量，确定尿素的最适添加量。其产酸结果如图1所示。图1显示，尿素添加量在0.6%时产酸最高。尿素添加量低于此值，则氮源偏低而影响产酸，尿素添加量超过此值可能会对菌体产生一定的毒性从而影响菌体生长代谢。

表5 尿素添加量对产酸的影响

3 结束语

以木薯清液为原料，用50L发酵罐进行柠檬酸发酵实验，接种量10～12%，发酵起始pH值控制为4.5～5.0，发酵温度37～39℃，罐压0.1Mpa，尿素添加量为0.6%，发酵68h产酸可达16.5%（w/v），残总糖≤1.0%（w/v），糖酸转化率≥98.1%。

参考文献

[1]金其荣.有机酸发酵工艺学[M].北京： 中国轻工业出版社，1992.

[2]朱俭.生物化学实验[M].上海： 上海科学技术出版社， 1981.

[3]陈坚，堵国成，李寅，等.发酵工程实验技术[M].化学工业出版社， 2003： 70-71.

[4]陈燕飞.pH对微生物的影响[J].太原师范学院学报（自然科学版）， 2009（3）： 121-124.

[5]朱亨政.柠檬酸发酵[M].食品与发酵工业， 1994（06）： 69-74.endprint