TTF-1启动子调控microRNA-7真核表达载体的构建

陈 超，赵娟娟，胡 艳，郭萌萌，陶弋婧，周 涯，秦娜琳，郑 静，徐 林

(1.遵义医学院 免疫学教研室暨贵州省免疫学研究生创新基地，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院 医学物理学教研室，贵州 遵义 563099)

近年来研究显示，一类长度大约22nt的非编码小分子RNA-微小RNA(microRNA,miRNA)在肺癌发生中具有关键调控作用，且逐渐发展为肺癌临床诊断和基因治疗的重要靶标[1-4]。新近研究显示miRNAs家族成员miR-7在肺癌发生中具有重要作用，其低表达与肺癌的转移相关[5]。我们前期研究发现miR-7模拟物(mimics)可显著抑制人肺癌细胞的体外增殖[6]。此外，基于CMV启动子的miR-7的真核表达载体过表达miR-7可显著抑制人肺癌细胞体内外生长、侵袭和转移[7-9]。然而，miR-7为代表的miRNAs分子是否可作为临床肺癌基因治疗或诊断靶标仍待继续研究探讨。

甲状腺转录因子-1(thyroid transcription factor-1,TTF-1)基因是1989年civitarale等在甲状腺滤泡上皮细胞中发现的一种转录因子，其特征性表达于甲状腺滤泡上皮细胞和肺上皮细胞中[10]。研究发现TTF-1在肺癌组织中高表达，且其表达水平与肺癌预后密切相关，提示其可作为肺癌基因靶向表达的重要候选靶标[11-12]。因此本研究中，我们拟利用分子克隆技术，构建TTF-1启动子调控miR-7的真核表达载体，并初步探讨该真核载体过表达miR-7对人肺癌细胞体外生长的可能影响，以期为后续基于miR-7的临床肺癌诊断和基因治疗新靶标开发提供前期实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器 PCR试剂，Premix Ex Taq Version2.0，限制性内切酶，快速连接酶均购自Takara公司；引物合成由上海英骏公司完成，PGL3-basic载体购自Promega公司。质粒抽提试剂盒购自天根生化科技有限公司；DNA凝胶回收试剂盒购自碧云天公司。人源性肺巨细胞癌95D细胞株，购于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。DH5α大肠杆菌菌株由本实验室保存。SW-CJ-2FD型超净工作台(苏州净化设备厂)；空气恒温摇床(上海新苗医疗器械制造公司)；TD5A-WS台式低速离心机(湘仪仪器)；IX-51倒置显微镜(OLYMPUS)；低温台式高速离心机(Thermo公司)；-80℃超低温冰箱(Thermo公司)。

1.2 PCR扩增miR-7基因 根据pri-miR-7序列设计引物。上游引物:5’-CGACGCGTAAGAGAGAAATGAGCCACTTGC-3’；下游引物：5’-CCCAAGCTTCCTGCCACAGTGGGGGATG-3’； 划痕为酶切位点。以人肺癌95D细胞基因组DNA为模板，PCR扩增miR-7序列，PCR条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；56 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min；35个循环；72℃ 10 min。

1.3 PGL3-basic-miR-7载体的构建 将miR-7的PCR产物克隆入PGL3-basic载体中，连接产物经转化、挑克隆、摇菌后提取质粒，使用限制性内切酶Mul I酶和Hind Ⅲ酶做双酶切鉴定，酶切鉴定后测序，通过测序鉴定后得到正确的重组质粒PGL3-basic-miR-7。

1.4 PCR扩增TTF-1启动子基因 根据TTF-1启动子序列设计引物。上游引物：5’-CGGGGTACCTGTTTCGGCAACTAC-3’；下游引物：5’-CGACGCGTCCTTCTGGGTCCTT-3’；划痕为酶切位点。以人肺癌95D细胞基因组DNA为模板，PCR扩增TTF-1启动子序列，PCR条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 2 min20 s；35个循环；72 ℃ 10 min。

1.5 p-T-miR-7载体的构建 将TTF-1启动子的PCR产物克隆入PGL3-basic-miR-7载体中，连接产物经转化、挑克隆、摇菌后提取质粒，使用限制性内切酶Kpn I酶和Mul I酶做双酶切鉴定，酶切鉴定后测序，通过测序鉴定后得到正确的重组质粒p-T-miR-7。

1.6 Real-time PCR探针法分析各组细胞中miR-7表达情况。

1.6.1 引物设计 GAPDH 上游(5’-3’)GGTGAAGGTCGGAGTCAACG。下游(5’-3’) CAAAGTTGTCATGGATGGACC。miR-7逆转录GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-TCGCACTGGATACGACACAACAA，下划线部分为茎环结构。

注：A:下划线部分为酶切位点。 图1 PGL3.0-Basic-TTF-1-promoter-miR-7真核表达载体

1.6.2 总RNA提取 以上各组细胞用0.2%胰酶消化，加入适量完全培养基终止消化，移至离心管中，1 200 rmp离心5 min，取出倒掉上清液，弹开管底的沉淀物。向离心管中加入适量的 RNAiso Plus(10 cm295D细胞加入1 mL RNAiso Plus)，轻轻吹打，吸出至1.5 mL EP管，室温静置5 min，至完全融化。12 000g 4 ℃离心5 min，吸取上清液，移入新1.5 mL EP管中。向匀浆裂解液中加入氯仿(RNAiso Plus的1/5体积)，剧烈振荡15s，待溶液充分乳化后，室温静置5 min，12 000g 4 ℃离心15 min。取出离心管，吸取上清液转移至另一新的离心管中，向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒充分混匀后，室温下静置10 min。12 000 g 4 ℃离心10 min。小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75%的乙醇1 mL，轻微上下颠倒洗涤，12 000 g 4 ℃离心5 min后弃去乙醇。室温干燥沉淀2～5 min，加入适量的RNase-free水溶解沉淀。1.0%琼脂糖凝胶电泳分析RNA完整性。

1.6.3 Real-time PCR探针法检测miR-7表达 内参基因GAPDH逆转录反应体系及条件按试剂盒说明书操作，Real-time PCR反应体系及条件： 2×SYBR®Premix Ex TaqTM10 μL，ddH2O 8 μL，cDNA 1μL，PCR Forward Primer(10 μM) 0.5 μL，PCR Reverse Primer(10μM)0.5 μL；95℃预变性30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环；84 ℃采集荧光信号，以排除引物二聚体的干扰。miR-7逆转录反应体系及条件按试剂盒说明书操作，Real-time PCR反应体系及条件：20×TaqMan®Small RNA Assay 1 μL，cDNA 1 μL，PCR Master Mix II 10 μL，ddH2O 8 μL；95 ℃预变性30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环；60 ℃采集荧光信号[7]。

1.7 CCK-8实验检测细胞增殖情况 95D细胞以3×103个细胞/孔接种于96孔培养板，每孔培养基总量200 μL，分别将p-T-miR-7重组质粒和p-Cont质粒转染细胞，于37 ℃、5% CO2的条件下培养72 h；每孔加入10 μL CCK-8，继续培养3 h；使用酶标仪检测各孔吸光度(OD)值(波长450 nm)。

1.8 划痕实验检测95D细胞的体外迁移 收集95D细胞，按细胞密度1×105个细胞/孔接种于24孔板，培养12 h；分别转染p-T-miR-7质粒和p-Cont质粒，培养6 h；用1mL枪头沿板中线刮出2 mm刮痕，PBS洗涤3次，显微镜下观察刮痕内无细胞，加入培养基，继续培养48 h；光学显微镜下计算刮痕内细胞总数，并拍照。

1.9 克隆形成实验检测95D细胞的长期体外生长 分别转染p-T-miR-7质粒和p-Cont质粒，培养48 h；分别制成细胞悬液；将各转染组按200、800个细胞/孔接种于6孔板中；置37 ℃、5%CO2中培养10～15 d，中间根据培养基变化适时更换新鲜培养基，当出现肉眼可见克隆时，终止培养，倒掉孔里的培养基，PBS小心洗涤2次，空气干燥，4%多聚甲醛固定30 min，空气干燥，用1%结晶紫染液染色30 min，洗去染液，干燥后拍照。

2 结果

2.1 PGL3-basic-miR-7真核表达载体的构建 以人肺癌95D细胞基因组DNA为模板，PCR扩增miR-7前体序列，琼脂糖凝胶电泳后在1302bp左右的位置出现目的条带(见图2A)。经Mul I酶和Hind Ⅲ酶双酶切纯化后，亚克隆入PGL3-basic载体中，连接产物经转化、挑克隆、摇菌后做菌液PCR鉴定(见图2B)。进一步提取质粒，利用Mul I酶和Hind Ⅲ酶做双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳出现了1302bp和4818左右的两条带(见图2C)。并通过质粒测序结果(见图2D)，证明PGL3-basic-miR-7载体构建成功。

注：A：PCR扩增miR-7片段；B：菌液PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；C：重组质粒的双酶切鉴定；D：重组质粒的测序鉴定。 图2 PGL3-basic-miR-7载体构建

2.2 p-T-miR-7真核表达载体的构建 以人肺癌95D细胞基因为模板，PCR扩增TTF-1启动子序列，琼脂糖凝胶电泳后在2300bp左右的位置出现目的条带(见图3A)。经Kpn I酶和Mul I酶双酶切纯化后，亚克隆入PGL3-basi-miR-7载体中，连接产物经转化、挑克隆、摇菌后做菌液PCR鉴定(见图3B)。进一步提取质粒，利用Kpn I酶和Mul I酶做双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳出现了2300bp和6120bp左右的两条带(见图3C)。并通过质粒测序结果(见图3D)，证明载体构建成功。

2.3 重组质粒p-T-miR-7瞬时转染人肺癌细胞后miR-7的表达水平 我们将p-T-miR-7重组质粒和p-Cont质粒分别体外瞬时转染人肺癌95D细胞。72 h后，观察细胞中miR-7成熟体的表达水平。结果显示，与对照组p-Cont转染组相比，p-T-miR-7转染组中miR-7成熟体的表达水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05，见图4)。

2.4 瞬时转染p-T-miR-7抑制95D细胞体外增殖 我们进一步观察了人肺癌95D细胞体外生长的变化。光镜下观察发现，与p-Cont转染组相比，p-T-miR-7转染组95D细胞的生长明显受到抑制，细胞数量明显减少(见图5A、B、C、D，P<0.05)；CCK-8检测结果表明，细胞的增殖能力明显下降，1.5μg和2.0μg重组质粒转染组的D值分别为0.85±0.02和0.83±0.02，与p-Cont组D值1.22±0.02相比，差异具有统计学意义(P<0.05，见图5E)。

注：A：PCR扩增TTF-1启动子片段；B：菌液PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；C：重组质粒的双酶切鉴定；D：重组质粒的测序鉴定。 图3 p-T-miR-7载体构建

图4 Real-time PCR方法检测p-T-miR-7转染人肺癌95D细胞后miR-7的表达

2.5 瞬时转染p-miR-7抑制95D细胞的长期体外生长 我们进而利用克隆形成实验，观察了p-T-miR-7转染后对人肺癌细胞长期生长的作用。结果显示，在接种200 cells/well和800 cells/well条件下，p-T-miR-7转染组中95D细胞的克隆形成数较p-Cont转染组均明显降低(11±3 vs 30±3个，P<0.05；80±3 vs 160±4个，P<0.05)(见图6A～D)。这提示，p-T-miR-7转染组中95D细胞的长期生长能力也显著削弱。

2.6 瞬时转染p-T-miR-7抑制95D细胞的体外迁移 我们前期研究显示，miR-7模拟物(mimics)可显著抑制人肺癌细胞的体外迁移能力。为了进一步明确利用p-T-miR-7载体表达miR-7对人肺癌细胞的生物学特性的影响，我们又观察了95D细胞体外迁移的变化。划痕法结果显示：与p-Cont组相比，p-T-miR-7组细胞的体外迁移能力受到显著抑制(120±5，45±3，40±3，P<0.05)，提示p-T-miR-7载体表达miR-7可抑制95D细胞体外迁移能力。

注：A：p-Cont组(2μg)； B：p-T-miR-7组(1.5μg)；C：p-T-miR-7组(2μg)；D：A-C组的细胞计数比较(*P<0.05)，E：CCK-8实验结果(*P<0.05)。 图5 瞬时转染p-T-p-miR-7对人肺癌95D细胞体外生长的影响(×100)

注：A、B：p-Cont转染组；C、D：p-T-miR-7转染组。A、C：200cells/well;B、D：800cells/well。 图6 转染p-T-miR-7抑制人肺癌95D细胞的克隆形成能力

注：A：p-Cont组(2μg)；B：p-T-miR-7组(1.5μg)；C：p-T-miR-7组(2μg)；D：A～C组划痕部位的细胞计数比较(*P<0.05)。图7 p-T-miR-7转染抑制人肺癌95D细胞的体外迁移(×100)

3 讨论

现有的临床肺癌治疗的主要方法有外科手术治疗、化学治疗、放射治疗。但肺癌的发生、侵袭和转移过程十分复杂，涉及多因素、多水平的分子调控机制，因此现有的治疗方法的疗效仍十分有限[13-15]。所以新治疗策略的开发仍显得十分必要。肿瘤的基因治疗技术是近年来得到快速发展的一项生物学新技术，主要指将外源或内源基因导入肿瘤细胞以达到治疗肿瘤的目的。目前，已知与肺癌的发生、发展和转移密切相关的基因数目庞大且机制复杂，其中近年发现的一类小分子RNA-miRNAs与肺癌间的关系已成为该领域的研究热点和重点之一[16-17]。

越来越多的研究表明，miRNAs分子参与调控了生物体的生长发育过程并参与一系列的生命活动，如细胞的生长、侵袭、凋亡等等。如：我们在前期研究中发现miR-7在正常脑、胸腺、淋巴结等组织中均高表达，尤其以肺组织表达水平最高[18]。而在临床肺癌组织中，miR-7的表达水平则显著降低，且与肺癌细胞的转移密切相关[5]。同时，体外利用miR-7模拟物(mimics)可显著抑制人肺癌细胞的体外增殖[6]。而Xiong[19]等的研究发现，miR-7在非小细胞肺癌细胞中呈现低表达，而miR-7模拟物可以抑制细胞的增殖和迁移并诱导其凋亡。此外他们的研究还显示，miR-7的表达水平与Bcl-2呈负相关性。因此，该miRNA的缺失或表达水平下调，均可导致Bcl-2表达水平的升高，从而促进肺癌的发生。Lee等[20]的研究还提示，miR-7还可以增加肺癌细胞对化疗的敏感性。我们在近期的研究中利用分子生物学技术成功构建了基于CMV启动子的miR-7的真核表达载体，发现过表达miR-7可显著抑制人肺癌细胞体内外生长、侵袭和转移[7-9]。以上的研究表明：改变肿瘤细胞中特定miRNA分子的表达水平将为肺癌的基因治疗提供了新的策略和尝试。

在本研究中，我们构建了TTF-1启动子调控miR-7表达的真核表达载体，并观察其在体外的表达活性。我们以人肺巨细胞癌细胞系95D细胞基因组DNA为模板，利用PCR分别扩增TTF-1启动子序列和miR-7前体序列，纯化产物分别经Kpn I和Mul I双酶切与Mul I和HindⅢ双酶切，克隆入pGL3-basic-载体，分别经菌液PCR、双酶切鉴定以及测序验证，结果表明成功构建了真核表达载体PGL3-basic-TTF-1-promoter-miR-7(命名为p-T -miR-7)。此外，我们发现将p-T-miR-7瞬时转染人肺癌95D细胞可显著增加miR-7成熟体的表达水平，提示TTF-1启动子可有效启动miR-7在真核细胞中的表达。重要的是，CCK-8实验和克隆形成实验进一步显示，转染p-T-miR-7后，95D细胞的增殖和生长能力受到明显抑制。同时划痕法检测结果显示p-T-miR-7载体过表达miR-7后还可显著抑制95D细胞的体外迁移，与我们前期发现CMV启动过表达miR-7的结果是一致的[8-9]。这些结果提示基于TTF-1启动子调控的miR-7真核表达载体可有效表达miR-7成熟体，且具有显著的生物学效应。然而，TTF-1调控miR-7表达在人肺癌细胞中的确切靶向性仍待后续研究探讨。

总之，在本研究中我们成功构建TTF-1启动子调控的miR-7真核表达载体，这为后续开发基于miR-7靶向基因治疗肺癌的新策略提供了重要的前期实验基础。

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