响应面法优化灯心草多糖的超声提取工艺

陈 帅，王慧竹，薛健飞

(吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林吉林132022)

灯心草 Juncus effusus L.［J.effusus L.var.decipiens Buchen.;J.decipiens(Buchen.)Nakai］又名碧玉草(《本草纲目》)，水灯心(《植物名实图考》)，秧草(《长白山植物志》).生于水旁、田边等潮湿处，在长江下游及福建、四川、贵州、陕西等地均有分布，江苏、苏州地区及四川亦有栽培［1］.本植物的根及根茎亦供药用，药用灯心草(Medulla Junci)为灯心草科灯心草属植物灯心草的茎髓或全草，性微寒，味甘、淡，归心、肺、小肠、膀胱经，主治热淋、水肿、小便不利、湿热黄疸，心烦不寐、小儿夜啼、喉痹、口舌生疮等症［2］.茎髓含多种菲类衍生物、挥发油、酮类成分、酚类成分、黄酮类成分以及多糖类化合物［3-8］.本实验利用响应面法对灯心草多糖的超声提取工艺进行研究，优选出易操作、成本低、得率高且适合工业化生产的工艺条件，为今后灯心草的综合利用提供理论依据.

1 实验部分

1.1 材料与试剂

灯心草，由安国中药饮片批发提供，吉林大学药学院生药教研室鉴定为灯心草属灯心草科植物灯心草(Juncus effusus L.)的干燥精髓;葡萄糖(分析纯)国药集团化学试剂有限公司;乙醇(分析纯)、浓硫酸(分析纯)、苯酚(分析纯)天津大茂化学试剂厂.

1.2 仪器与设备

FA2004N电子分析天平上海精密科学仪器有限公司;W5-100SP恒温水浴锅 上海申生科技有限公司;T6新世纪紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;KQ5200DE超声波清洗机 昆山市超声仪器有限公司;JY2002电子天平上海市精密仪器有限公司;RE-52旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂;DHG-9076A电热恒温鼓风干燥箱上海一恒科学仪器有限公司;SHZ-D循环水真空泵河南巩义市予华责任有限公司.

1.3 实验方法

1.3.1 灯心草多糖的提取

灯心草→粉碎→蒸馏水超声提取→过滤→滤液→醇沉→离心→真空干燥→收集浸膏→含量测定→数据分析→确定最佳提取工艺.

1.3.2 标准曲线的建立

精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖对照品0.020 6 g，置100 mL容量瓶中，加入蒸馏水溶解，并稀释至刻度.分别精密吸取上述溶液6、8、10、12、14、16 mL于50 mL容量瓶中以蒸馏水稀释至刻度.取上述溶液各2 mL于10 mL容量瓶中加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5 mL，摇匀，在40℃水浴中保温30 min后冰浴放置5 min，依照分光光度法，以相应溶剂作空白，在490 nm波长处测定吸光度［9-11］.以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程A=59.604C+0.010 4，R2=0.999，结果表明葡萄糖在4.944～13.18μg·mL-1范围内呈良好的线性关系.

1.3.3 灯心草多糖含量的测定

精密称量灯心草多糖样品粉末0.010 0 g，置于50 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解，定容至刻度，即得供试品溶液.取2 mL供试品溶液于10 mL容量瓶中，按“1.3.2”项下方法进行吸光度测量，然后按以下公示计算提取率.

其中，w%为灯心草多糖提取率;A为吸光度;m2为所得浸膏质量;m1为称取灯心草的质量.1.3.4 单因素实验

以蒸馏水为溶剂，固定超声频率为59 KHz，提取次数为2次，分别考察超声时间、浸提温度、浸提时间、料液比对灯心草多糖提取率的影响.在单因素实验的基础上利用星点设计和响应面法优化灯心草多糖的提取工艺.

(1)超声时间对多糖提取率的影响

准确称取2.0 g粉碎度40的灯心草粉末5份，分别置于100 mL圆底烧瓶中，在浸提温度70℃，浸提时间 2 h，料液比 70 1，超声频率59 KHz，浸提2次条件下，分别超声提取10、20、30、40、50 min.

(2)浸提温度对多糖提取率的影响

准确称取2.0 g粉碎度40目的灯心草粉末5份，分别置于100 mL圆底烧瓶中，固定浸提时间2 h，料液比701，超声频率59 KHz，浸提次数2次，分别在浸提温度 60、65、70、75、80 ℃的条件下超声提取20 min.

(3)浸提时间对多糖提取率的影响

准确称取2.0 g粉碎度40目的灯心草粉末5份，分别置于100 mL圆底烧瓶中，固定浸提温度75℃，料液比70 1，超声频率59 KHz，浸提次数2次，分别在浸提时间 1、1.5、2、2.5、3 h 的条件下超声提取20 min.

(4)液料比对多糖提取率的影响

准确称取2.0 g粉碎度40目灯心草粉末5份，分别置于100 mL圆底烧瓶中，固定浸提温度75℃，浸提时间2 h，超声频率59 KHz，浸提次数2次，分别在料液比70 1、80 1、90 1、100 1、110 1的条件下超声提取20 min.

1.3.5 响应面法优化分析

在单因素试验的基础上，根据星点实验设计原理，选取超声时间、浸提温度、浸提时间、液料比四个对灯心草多糖提取率的影响较为显著的因素作为试验因素，以多糖提取率为响应值设计实验，实验的因素水平见表1，实验结果采用SAS8.0软件进行分析.

表1 响应面实验因素水平

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 超声时间对多糖提取率的影响

从图1可看出，随着超声时间的增加，灯心草多糖提取率逐渐上升，超声时间为20 min时多糖提取率最高，随后多糖提取率随超声时间的增加反而下降.因此超声时间选20 min左右比较适宜.

图1 超声时间对多糖提取率的影响

2.1.2 浸提温度对多糖提取率的影响

从图2可看出，随着浸提温度的上升，灯心草多糖提取率逐渐增大，浸提温度为75℃时多糖提取率最大，超过75℃后多糖提取率急剧下降.因此浸提温度选75℃左右比较适宜.

图2 浸提温度对多糖提取率的影响

2.1.3 浸提时间对多糖提取率的影响

从图3可看出，随着浸提时间的延长，灯心草多糖提取率逐渐增大，浸提时间为2.0 h时多糖提取率最大，超过2 h后多糖提取率呈下降趋势.因此浸提时间选2 h左右比较适宜.

图3 浸提时间对多糖提取率的影响

2.1.4 液料比对多糖的影响

从图4可看出，液料比为80 1 mL/g时多糖提取率最大，然后随着料液比的增大多糖提取率呈下降趋势.因此料液比选80 1 mL/g左右比较适宜.

图4 液料比对多糖提取率的影响

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面试验结果

对超声时间A、浸提温度B、浸提时间C、料液比D作如下变换:X1=(A-20)/10，X2=(B-75)/5，X3=(C-2)/0.5，X4=(D-80)/10.以多糖提取率为响应值(Y)，以 X1、X2、X3、X4为自变量，进行响应面试验，结果见表2.

表2 响应面试验设计及结果

其中实验号1-16是析因试验部分，17～24是星点试验部分，25～30是中心试验部分，中心试验重复6次，用以估计实验误差.

用SAS8.0软件对表2数据进行多元回归拟合，得出回归模型参数值及方差分析结果，见表3和表4.

表3 回归系数显著性检验

表4 回归方程的方差分析

由表3可知灯心草多糖提取率对编码自变量的二次回归方程为:

Y=0.56+0.047X1+0.060X2+0.057X3+0.034X4-0.057X21+0.007 6X1X2-0.032 X1X3+0.027X1X4-0.050X22-0.018X2X3+0.025X2X4-0.084X23-0.0073X3X4-0.051X24.在回归方程中，常数项、一次项X1、X2、X3及二次项 X1X1、X2X2、X3X3、X4X4都达到了极显著水平(P ＜0.01)，一次项X4和交互项X1X3、X1X4、X4X2系数呈显著水平(P＜0.05)，因此各实验因素对响应值的影响不是简单的线性关系［12］.所以，可以利用该回归方程确定灯心草多糖的最佳提取工艺.对回归方程及实验的各因素进行方差分析，结果如表4所示.

由表4可知，回归方程的P ＜0.01，说明所建立的二次多项式模型具有高度显著性，线性项和二次项的P＜0.01也说明具有高度显著性，模型的决定系数R2=0.954 5，说明响应值的变化有95.45%来源于所选变量，模型拟合度好，可以较准确地描述各实验因素与响应值之间的关系.

2.2.2 响应面分析

响应面图形是响应值对各试验因子X1、X2、X3、X4所构成的三维空间曲面图，从响应面分析图上可形象地看出最佳参数及各参数之间的相互作用.当特征值均为正值时，响应面分析图为山谷形曲面，有极小值存在;当特征值为负值时，为山丘曲面，有极大值存在;当特征值有正有负时，为马鞍形曲面，无极值存在［12］.根据回归模型绘制相应响应面曲线图和等高线图，如图5～10所示.

图5 超声时间(X1)和浸提温度(X2)对多糖提取率影响的响应面图

图6 超声时间(X1)和浸提时间(X3)对多糖提取率影响的响应面图

图7 超声时间(X1)和液料比(X4)对多糖提取率影响的响应面图

图8 浸提温度(X2)和浸提时间(X3)对多糖提取率影响的响应面图

图9 浸提温度(X2)和液料比(X4)对多糖提取率影响的响应面图

图10 浸提时间(X3)和液料比(X4)对多糖提取率影响的响应面图

由图5～10可以直观看出各因素对多糖提取率的影响，响应面的坡度越陡峭，表明响应值对于操作条件的改变越敏感，曲面坡度越小，表明操作条件改变对响应值的影响也越小，等高线图表明多糖提取率最大条件应该在圆心处.将图5～10对比分析可知多糖提取率随试验因子的增大均呈现先增大后减小的趋势，且响应曲面开口朝下，表明该模型有稳定点，且稳定点即为最大值［13-17］.

利用SAS软件RSREG语句对模型进行典型性分析，得到灯心草多糖提取最佳工艺为超声时间25.86 min、浸提温度78.91℃、浸提时间2.05 h、液料比86.64 1 mL/g，在此工艺条件下灯心草多糖的提取率理论值得到0.607 4%，但考虑实际情况，将最佳工艺条件修正为超声时间25.9 min、浸提温度78.9℃、浸提时间2.05 h、料液比86.6 1 mL/g.在此修正工艺条件下进行试验验证，重复3次，测得多糖平均提取率为0.613 2%，多糖提取工艺验证试验值与理论值的差值仅占理论值的0.95%.可见预测模型较好地反映出灯心草多糖的提取工艺条件，从而也证明了响应面法确定灯心草多糖的提取工艺条件的可行性.

3 结 论

本研究通过单因素实验考察了超声时间、浸提温度、浸提时间、料液比对多糖提取率的影响，将超声时间考察范围定为10～50 min，浸提温度考察范围定为60～80℃、浸提时间考察范围定为1～3 h，液料比考察范围定为1 70～1 110.通过星点设计-响应面法，建立了超声提取灯心草多糖的数学模型，模型的决定系数为0.954 5，方程显著，拟合良好，可以进行实际预测，并最终确定灯心草多糖超声提取的最佳工艺参数为:超声时间25.9 min、浸提温度78.9℃、浸提时间2.05 h、液料比86.6 1 mL/g.

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