葛根异黄酮对大鼠前列腺增生的影响

程斯倩，赵丽晶，于馨洋，李海雪，张 赫，郭二勤，刘 欢，李宗洲

(吉林医药学院，吉林 吉林 132013)

·论 著·

葛根异黄酮对大鼠前列腺增生的影响

程斯倩，赵丽晶*，于馨洋，李海雪，张 赫，郭二勤，刘 欢，李宗洲

(吉林医药学院，吉林 吉林 132013)

目的 探讨葛根异黄酮对丙酸睾酮诱导的去势大鼠前列腺增生的抑制作用及其发生机制。方法 雄性Wistar大鼠，随机分为6组。空白组大鼠行假手术(其余均行去势手术)。饲养7 d后，除空白组注射生理盐水外，其余5组均皮下注射丙酸睾酮10 mg/(kg·d)，连续注射10 d，复制前列腺增生模型。随后隔两日一次皮下注射丙酸睾酮维持，阳性对照组灌胃非那雄胺1.0 mg/(kg·d)，葛根异黄酮高、中、低剂量组按照180、120、60 mg/(kg·d)灌胃，其余两组给予生理盐水，连续给药35 d。取血清，测定前列腺特异性酸性磷酸酶活力；分离前列腺组织，称重，计算前列腺指数(PI)；用足趾容积测量仪测前列腺体积的变化；光镜下观察前列腺组织形态的变化。结果 各剂量组葛根异黄酮对大鼠前列腺湿重、体积及PI相对模型组有明显影响(P<0.05)。组织形态学观察,不同剂量的葛根组均可缓解由丙酸睾酮所致的大鼠前列腺增生的症状，表现为上皮变薄，腺腔内分泌物减少，间质减少等。结论 葛根异黄酮对大鼠前列腺增生有一定抑制作用。

良性前列腺增生；葛根异黄酮；去势

良性前列腺增生(benign prostatic hyperlasia，BPH)[1-2]是常见的中老年男性进行性疾病[3]，多在40岁左右开始发病。据统计，45岁以上的男性发病率为42%～90%[4]，并随年龄增长而逐年增高，到80岁可高达70%～80%[5]。主要症状有夜尿、尿急、尿频、排尿困难等，此疾病严重影响了中老年人的生活质量和身心健康。葛根异黄酮是葛根中的主要有效成分，包括葛根素、3-羟基葛根素、3-甲氧基葛根素、葛根素-木糖苷、大豆苷元、大豆苷、芒柄花素、染料木苷、染料木素等，其中葛根素占主体[6]。葛根异黄酮具有降低血糖、降低血脂、增强免疫、抗氧化、雌激素样作用[7]等，现在临床上葛根异黄酮中的葛根素主要应用于心血管疾病[8]的治疗，而其对前列腺增生的抑制作用尤其是其治疗机制的研究等方面国内外报道尚少。本研究建立在前期工作的基础上，初步探讨葛根异黄酮对前列腺增生的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

丙酸睾酮注射液由上海通用药业股份有限公司生产(生产批号：090303)；非那雄胺片(5mg/片)由杭州默沙东制药有限公司生产(生产批号:120101)；葛根异黄酮由西安天一生物技术有限公司生产(纯度60%～90%)；前列腺特异性酸性磷酸酶(PACP)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 仪 器

电子分析天平，上海奕宇电子衡器有限公司；FA(N)/JA(N)系列电子天平，上海民桥精密仪器有限公司；GT10-2高速台式离心机，北京时代北利离心机有限公司；ZH-YLS-7A型足趾容积测量仪，安徽省淮北正华生物仪器设备有限公司；722可见分光光度计，上海现科仪器有限公司。

1.3 实验方法

72只雄性Wistar大鼠由吉林大学动物实验中心提供,编号SCXK-(右)2008-0005,随机分为6组，每组各12只，即空白组、模型组、阳性对照组和葛根异黄酮高剂量组、中剂量组、低剂量组。大鼠适应性饲养5 d后，空白组大鼠行假手术，其余5组大鼠均行去势手术，适应性饲养7 d。将空白组大鼠皮下注射生理盐水10 mg/(kg·d)，其余组大鼠均皮下注射丙酸睾酮10 mg/(kg·d)，连续注射10 d后。随后隔两日皮下注射原剂量丙酸睾酮(空白组注射生理盐水)的同时，将空白组和模型组大鼠1.0 mg/(kg·d)生理盐水灌胃，阳性对照组给予非那雄胺1.0 mg/(kg·d)灌胃，葛根异黄酮高剂量组180 mg/(kg·d)、葛根异黄酮中剂量组120 mg/(kg·d)、葛根异黄酮低剂量组60 mg/(kg·d)分别灌胃相应剂量的葛根异黄酮，连续进行35 d。

1.4 指标检测

测定血清前列腺特异性酸性磷酸酶活力(PAP)：末次给药后，禁食水24 h，称重，以10%水合氯醛3 mL/kg麻醉，于腹主动脉取血，将血液离心10 min(2 500 r/min)，取上层血清按试剂盒说明测定PAP活力。

前列腺指数计算：分离前列腺组织，称量其湿重(mass)，并计算前列腺指数(PI)[PI =前列腺湿重(mg)/体重(g)]。用足趾容积测量仪测前列腺体积。

HE染色观察前列腺组织形态学改变：将前列腺组织放入10%的福尔马林溶液中固定，经石蜡包埋、连续4 μm切片、常规HE染色，光镜下观察组织形态学变化。

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 前列腺指数及血清PAP活力测定结果

与空白组相比,模型组PI及前列腺质量均增高，且有显著统计学意义(P<0.01)。与模型组相比，葛根异黄酮中剂量组、低剂量组的前列腺质量和PI均降低，差别有统计学意义(P<0.05)，高剂量组PI降低，有显著差异(P<0.01)，但葛根异黄酮高、中、低剂量组PAP差异均无统计学意义(P>0.05)；与模型组相比，葛根异黄酮高、中剂量组和阳性对照组的前列腺体积均降低，有显著差异(P<0.01),见表1。

2.2 大鼠前列腺组织形态学观察

空白组(图1)前列腺腺腔大小、细胞核大小、形态较一致，扩张不明显，被覆单层立方或矮柱状上皮，基底膜完整，腺上皮较光滑，排列规则，无乳头状结构，管腔内见淡粉染均质状物，间质内未见血管充血、炎细胞浸润和纤维结缔组织增生，无坏死。

表 1 各组大鼠中前列腺质量、前列腺指数、前列腺体积和PAP水平的变化±s，n=12)

与对照组相比，△P<0.01;与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01

模型组(图2)前列腺腺腔大小不一，腺体增生，腺腔扩张明显，腺上皮呈柱状及高柱状，排列较为紊乱,呈乳头状向腺腔内凸出,显示腺体上皮组织增生活跃,腔内充满粉色浓染均质状物，间质增宽，其内血管高度扩张充血，并可见淋巴、单核细胞浸润及纤维结缔组织增生，局部见变性、坏死。证明造模成功。

与模型组(图2)相比，阳性对照组(图6)腺体成分减少，呈萎缩样改变，间质明显减少；葛根异黄酮高剂量组(图3)腺上皮较光滑，排列规整，间质减少，组织学形态更接近空白组；葛根异黄酮中剂量组(图4)乳头状结构减少;而低剂量组(图5)组织形态无明显改变。

与阳性对照组(图6)相比，葛根异黄酮高剂量组(图3)组织形态无明显差异；葛根异黄酮中剂量组(图4)呈现一定增生状态。

图 1 空白组(HE 300×) 图 2 模型组(HE 300×)

图 3 高剂量组(HE 300×) 图 4 中剂量组(HE 300×)

图 5 低剂量组(HE 300×) 图 6 阳性组(HE 300×)

3 讨 论

目前，前列腺增生的确切病因与发病机制不明，国内外学者经过大量研究提出了多种学说：上皮-间质细胞相互作用学说、内分泌激素作用学说、细胞凋亡学说、生长因子学说等[9]。其中内分泌激素作用学说是阐述较为详尽的一种学说。下面着重就内分泌激素作用学说方面进行说明。

雄激素是影响前列腺生长的主要物质，人体前列腺内的雄激素90%来自睾丸，10%来自肾上腺素。雄激素本身不能直接对前列腺发挥作用，需在5α-还原酶作用下生成双氢睾酮(DHT)[10]，前列腺间质细胞核膜上主要存在5α-还原酶Ⅱ型，生成的DHT与前列腺腺上皮细胞核膜上的雄性激素受体(AR)结合成DHT-AR复合物，入胞后作用于特异性的DNA结合位点，促进雄性激素依赖性基因的复制、转录和蛋白合成，同时DHT-AR复合物刺激间质细胞产生各种生长因子[11]，后者经自分泌、旁分泌的方式发挥它们对上皮细胞的促分裂原作用。

雌激素作为前列腺基质细胞的刺激剂与雄激素协同导致BPH：循环血中的雌激素与性激素结合蛋白(SHBG)结合入间质细胞，与间质细胞核膜上的雌激素受体结合入核，调节DNA复制、蛋白质合成，同时雌激素还可上调AR水平[12-13]。

随着年龄的增长男性体内雄激素水平下降，雄激素/雌激素比下降,雌激素促进前列腺基质细胞增殖的作用增强，导致了前列腺增生[14]。以往实验研究表明植物雌激素在肠道菌群的作用下主要代谢为肠二醇和肠内脂(ENL)，ENL通过与底物竞争雄烯二酮，抑制雄激素的合成[15]；植物雌激素还能抑制人体组织中5α-还原酶活性[16]，减少DHT的产生。另外，植物雌激素还可与身体各系统、器官、组织细胞表面的雌激素受体抢先结合，拮抗机体内雌激素发挥效应[17]。葛根异黄酮是目前在分子结构上与人体自身分泌的雌激素最为相似的一种植物雌激素。

本实验研究结果中葛根异黄酮高剂量组可以抑制大鼠前列腺增生，且疗效较接近阳性对照组。HE染色显示，葛根异黄酮高剂量组腺上皮较光滑，排列规整，间质减少，接近空白组和阳性对照组；葛根异黄酮中剂量与模型组相比乳头状结构减少；而低剂量组组织与模型组相比形态无明显改变，与阳性对照组相比，呈现一定增生状态。统计学显示，与空白组相比，模型组PI及前列腺质量均增高，且有显著统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，葛根异黄酮中剂量组、低剂量组质量和PI均降低，差别有统计学意义(P<0.05)，高剂量组PI降低,有显著差异(P<0.01)；与模型组相比，葛根异黄酮高、中剂量组和阳性对照组的前列腺体积均降低，有显著差异(P<0.01)，但葛根异黄酮高、中、低剂量组PAP差异均无统计学意义(P>0.05)。故葛根异黄酮可能通过改善体内性激素水平来达到治疗前列腺增生的目的。

总之，葛根异黄酮对良性前列腺增生的作用机制有待于进一步研究，而本实验通过研究葛根异黄酮对大鼠前列腺增生模型的影响，为开发植物性前列腺增生药物奠定了一定的实验基础。此外,在各种植物中，葛根内葛根异黄酮含量最高，而葛根是我国南方一些省区的一种常食蔬菜，开发和利用葛根将带来良好的经济和社会效益。

[1] Morán E，Budía A，Broseta E，et al.Phytotherapy in urology.Current scientific evidence of its application in benign prostatic hyperplasia and prostate adenocarcinoma[J].Actas Urol Esp,2013,37(2):114-119.

[2] Shrivastava A,Gupta V B.Various treatment options for benign prostatic hyperplasia:A current update[J].J Midlife Health,2012,3(1):10-19.

[3] Donnell，R F.Benign prostate hyperplasia:a review of the year’s progress from bench to clinic[J].Curr Opin Urol,2011,21(1):22-26.

[4] 吴符火,谢金东,谢学建,等.大鼠前列腺增生模型的建立[J].福建中医学院,2005，15(6):37-38.

[5] 林咏梅,陆 瑛.良性前列腺增生中西药治疗进展[J].云南中医药杂志,2007,28(4):48-50.

[6] 王爱梅.葛根异黄酮对更年期大鼠学习记忆及抗氧化作用的研究[J].中国现代药物应用,2009,3(24):68-69.

[7] Hwang Y P，Jeong H G.Mechanism of phytoestrogen puerarin-mediated cytoprotection following oxidative injury:estrogen receptor-dependent up-regulation of PI3K/Akt and HO-1[J].Toxicol Appl Pharmacol,2008,233(3):371-381.

[8] 狄 灵,于 燕,杨海侠,等.葛根素对心血管病作用机制的研究进展[J].中西医结合心脑血管病杂志,2009,7(3):328-330.

[9] 綦海燕,祝 海.前列腺疾病基础研究与诊疗新进展[M].北京:人民卫生出版社，2009.

[10] Bhasin S，Travison T G，Storer T W，et al.Effect of testosterone supplementation with and without a dual 5α-reductase inhibitor on fat-free mass in men with suppressed testosterone production:a randomized controlled trial[J].JAMA,2012，307(9):931-939.

[11] Zager M G，Barton H A.A multiscale，mechanism-driven，dynamic model for the effects of 5α-reductase inhibition on prostate maintenance[J].PLoS ONE,2012，7(9):e44359.

[12] Saha I，Chatterjee A，Mondal A,et al.Arecoline augments cellular proliferation in the prostate gland of male Wistar rats[J].Toxicol Appl Pharmacol，2011,255(2):160-168.

[13] Atawia R T，Tadros M G，Khalifa A E，et al.Role of the phytoestrogenic，pro-apoptotic and anti-oxidative properties of silymarin in inhibiting experimental benign prostatic hyperplasia in rats[J].Toxicol Lett,2013,219(2):160-169.

[14] 封玉宏,刘 龙,曹志强,等.雌激素受体在前列腺增生大鼠表达的变化及意义[J].临床医学工程,2013,20(1):21-22.

[15] 张文众,李 宁,李 蓉.大豆异黄酮的雌激素样作用研究[J].卫生研究,2008,37(6):707-709.

[16] Bae M，Woo M，Kusuma I W,et al.Inhibitory effects of isoflavonoids on rat prostate testosterone 5α-reductase[J].J Acupunct Meridian Stud,2012，5(6):319-322.

[17] 冯 耀,潘连军,夏欣一,等.植物雌激素大豆黄酮对大鼠前列腺生长发育及形态结构的影响[J].生殖与避孕,2008,28(4):210-214.

The influence of puerariae isoflavones on benign prostatic hyperplasia in emasculated rat

CHENG Si-qian,ZHAO Li-jing*,YU Xin-yang,LI Hai-xue,ZHANG He,GUO Ee-qin,LIU Huan,LI Zong-zhou

(Jilin Medical College,Jilin City，Jilin Province,132013，China)

Objective To study the inhibitory effect of pueraria isoflavones on prostate hyperplasia induced by testosterone in emasculated rats and clarify its mechanism. Methods 72 male Wistar rats were randomly divided into 6 groups,the control group(only Normal Saline，NS),the finasteride group[1.0 mg/(kg·d)],the model group,the pueraria isoflavones group[180,120,60mg/(kg·d) respectively].The rats in the control group underwent sham operation，the rest were emasculated operation.From the 8th day,except the blank control group,rats in the above-mentioned 5 groups were given Testosterone Propionate [10 mg/(kg·d)] by subcutaneous injection for continuous 10 days to copy prostatic hyperplasia model.Then maintaining with subcutaneous injection once every two days,the blank control group and model group were given normal saline[1.0 mg/(kg·d)],the finasteride group was given finasteride [1.0 mg/(kg·d)],the pueraria isoflavones groups were given for 35 days.On the 36th day,serum was taken and the PAP vitality was determined.Then the prostate was separated,and weighed,the index was calculated,prostate volume change using the toe volumetric measuring instrument and the histology and morphology of the prostate was observed. Results Pueraria isoflavone in different dose groups had significant effect on wet weight,volume and index of rat prostate (P<0.05).And alleviated the change of prostate caused by Testosterone Propionate:epithelium thinning,luminal secretion and interstitial substance decreased. Conclusion Pueraria isoflavone had inhibitory effect on benign prostatic hyperplasia in rats.

pueraria isoflavone;benign prostatic hyperplasia;emasculated

1673-2995(2014)01-0017-04

吉林医药学院大学生科研基金项目(201101).

程斯倩(1991-)，女(满族)，在读本科.

赵丽晶(1971-)，女(汉族)，副主任医师，本科.

R285

A

2013-08-17)