电针对便秘型肠易激综合征模型大鼠结肠降钙素基因相关肽及P物质mRNA表达的影响

张亚楠，王世军

(1.山东中医药大学基础医学院，济南 250355；2.山东中医药大学国际教育学院，济南 250355)

肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一种非器质性的肠道功能紊乱性疾病，其主要临床表现是腹部不适或腹部疼痛同时伴有排便习惯及粪便性状的改变[1]。罗马Ⅲ诊断标准和我国对IBS共识意见的更新使IBS成为研究的热点,但IBS的病因和发病机制目前尚不完全清楚,对其机制的研究也未达成共识。现在很多研究普遍认为IBS的发病是多因素综合作用的结果，已知的一些因素如肠道动力异常、精神心理异常、内脏感觉异常、植物神经功能紊乱、胃肠激素分泌异常、脑-肠轴学说、应激、肠道感染等都与肠易激综合征的发生密切相关[2]，IBS的发生直接受到中枢神经系统、内分泌系统和免疫系统的影响。国内外研究表明[3-5]内脏高敏性是IBS发病的关键环节，调节IBS患者内脏感觉可能为IBS的治疗带来新途径。 降钙素基因相关肽(calcitonin generelated peptide，CGRP)是胃肠道感觉信息传递的重要递质，在肠神经系统内，CGRP主要分布于黏膜下丛的初级传入神经细胞内，传递肠腔或肠壁的各种物理性和化学性刺激信号，参与调节胃肠道的功能活动[6-7]。P物质(SP)作为胃肠肽类激素和兴奋性神经递质，在消化系统的分泌和运动中起着十分重要作用,并且SP在IBS发病因素的肠道感染、神经免疫内分泌、应激、内脏敏感性增高等机制中均发挥重要作用。在前期的研究中发现电针治疗可以改善IBS的粪便性状，降低IBS模型大鼠血浆CGRP和SP的表达[8]。为了进一步了解CGRP和SP在电针治疗IBS中的作用，本研究通过建立便秘型IBS大鼠模型，观测电针对大鼠结肠组织中CGRP和SP基因表达的影响，从而探讨CGRP和SP在电针治疗便秘型IBS中的作用。

1 实验材料

1.1 实验动物 成年雄性Wistar大鼠32只,SPF级，体质量(180±20)g，购自山东鲁抗医药股份有限公司，许可证号为SCXK(鲁)20080002。饲养于山东中医药大学清洁级实验动物房，恒定温度湿度，室内温度控制在20～25 ℃。动物自由摄食及饮水。实验前1周动物予以适应实验环境，自由进食与饮水。

1.2 实验仪器和器材 韩氏疼痛治疗仪(HANS-100A)，南京济生医疗科技有限公司；毫针(规格0.30 mm×15 mm)，苏州环球针灸医疗器械有限公司；台式高速低温离心机(LEGEND MICRO 21R)，Thermo；7500实时荧光定量PCR仪，美国Applied biosystems公司。RNA提取试剂盒TRIzol Reagent，Invitrogen公司；SuperScript III RT kit，Invitrogen公司；1kb Plus DNA Ladder，Invitrogen公司；UltraPure Agarose，Takara公司；Platinum Taq DNA Polymerase，Invitrogen公司；10 mmol dNTP Set，Invitrogen公司。

2 实验方法

2.1 分组及造模 将32只Wistar大鼠采用随机数字表法分为正常组和实验组，正常组(C-N组)8只，实验组模型制备成功后随机分为模型组(C-M组)、电针上巨虚组(C-DS组)、电针大肠俞组(C-DD组)，每组8只。正常组大鼠每日给予26～28 ℃生理盐水2 mL灌胃1次，实验组模型大鼠每日给予0～4 ℃生理盐水2 mL灌胃1次，共14 d[9]。正常组与实验组除灌胃外均给予正常饮食，为消除生物节律的影响，每日灌胃均于上午8：30开始。

2.2 取穴及针刺 参照李忠仁等主编的《实验针灸学》大鼠标准穴位图谱定位，上巨虚穴位于大鼠后肢足三里向下约5 mm处;大肠俞位于腰部，当第4腰椎棘突下，旁开5 mm。造模成功后，将C-DS组和C-DD组的大鼠捆绑、束缚，取双侧的穴位，直刺进针约5 mm，穴位旁开5 mm平刺，接电针，电针参数为:疏密波，频率2/100 Hz，强度0.1～0.2 mA，以皮肤肌肉或针柄微微颤动但大鼠不产生嘶叫为度。造模成功后开始电针治疗，1次/d，每次30 min,连续7 d。C-M组只捆绑束缚30 min，不针刺。C-N组不进行任何处理。

2.3 实时荧光定量PCR检测结肠CGRP、SP mRNA的表达 治疗结束后，用10%水合氯醛4 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，在冰块上迅速取出大鼠的结肠，放置于-80 ℃冰箱保存。所有试验器材都经过灭活RNA酶处理。采用实时荧光定量PCR法测定结肠中CGRP、SP mRNA的表达，以TRIzol试剂提取结肠组织标本总RNA，采用逆转录酶将RNA逆转录成cDNA。GAPDH作为CGRP、SP的内参，二者均通过2-△△Ct法分析基因相对表达量。2-△△Ct相对定量分析的结果判断:循环阈值(△Ct)=样品Ct均值-内参照Ct均值，△△Ct=△Ct-(随机阴性对照样品Ct均值-该样品内参照Ct均值)。

实时定量PCR检测引物为：CGRP上游引物5’-TGCCCAGATCAAGAGTCACC-3’，下游引物5’-GTAGAACGACCCACCTGAGC -3’;SP上游引物5’-GAGCAGCGTGTACAAGGTCA -3’，下游引物5’-CCCAGTGCTAGGGTATTCCA-3’；GAPDH上游引物5’-CTTAGCACCCCTGGCCAAG-3’，下游引物5’-GATGTTCTGGAGAGCCCCG-3’。标准扩增条件为:95 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s共40个循环。

3 实验结果

3.1 电针对C-IBS大鼠CGRP mRNA表达的影响 电针治疗结束后，各组大鼠结肠CGRP mRNA相对表达量存在统计学差异。与C-N组相比，C-M组结肠组织CGRP mRNA的表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；C-DD组、C-DS组结肠组织CGRP mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。与C-M组相比，C-DS组结肠组织CGRP mRNA表达水平明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)。而C-DD组与C-DS组之间结肠组织CGRP mRNA表达水平未表现出明显统计学差异(P>0.05)。以上结果说明，C-IBS中结肠组织中CGRP激活，电针刺激可以降低结肠组织CGRP mRNA的表达。结果见表1。

表1 C-IBS各组大鼠结肠CGRP mRNA比较

注：与正常组相比较，##P<0.01；与模型组相比较，△△P<0.01

3.2 电针对C-IBS大鼠SP mRNA表达的影响 电针治疗结束后，各组大鼠结肠SP mRNA相对表达量存在统计学差异。与C-N组相比，C-M组结肠组织SP mRNA的表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；C-DD组、C-DS组结肠组织SP mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。与C-M组相比，C-DD组、C-DS组结肠组织SP mRNA表达水平明显下降，差异有统计学意义(P<0.01，P<0.01)。C-DD组与C-DS组之间结肠组织SP mRNA表达水平未表现出明显统计学差异(P>0.05)。以上结果说明，C-IBS中结肠组织中SP激活，电针刺激可以降低结肠组织SP mRNA的表达。结果见表2。

表2 C-IBS各组大鼠结肠SP mRNA比较

注：与正常组相比较，##P<0.01;与模型组相比较，△△P<0.01

4 讨论

肠易激综合征是一种非器质性的肠道功能紊乱性疾病，随着生活节奏的加快、工作压力的增大和社会竞争压力的增加,IBS的发病率呈逐年上升的趋势。在中医学中肠易激综合征没有特定的病名，根据临床特征如腹泻、腹痛、便秘和患者精神的症状，而归属于“泄泻”“腹痛”“便秘”及“郁症”等病症范畴[10]。

IBS的患者越来越年轻化，尽管对IBS的药物治疗、心理学相关治疗研究较多，但由于IBS不同亚型间临床症状和对药物反应的差别，故迄今为止没有一种对所有IBS病人均有效的药物，对IBS的治疗多以对症为主，单一药物作用局限,难以满足临床需要。针灸作为中医的独特疗法，在消化系统疾病方面的运用日趋广泛，被全世界的医生和患者接受和认可[11]。针刺对胃肠道具有良性调整作用，使失常的肠道运动机能趋向正常化，同时对神经、内分泌系统也有明显的调整作用。针刺治疗IBS具有疗效确切，毒副作用少的优点，但针刺治疗IBS的机制尚未完全阐明。

林庆等[12]取中脘、下脘、气海、关元、天枢等穴位治疗C-IBS患者，针灸治疗组的总有效率为95.9%，且作用持久、不易复发。杨秀丽等[13]以取大肠经、募穴及下合穴为主，针灸并用,治疗便秘型IBS患者72例。对照组30例患者给予麻仁软胶囊治疗。3个月之后，2组的总有效率均为100%。以上研究表明，针灸或电针治疗IBS取得了良好的效果，可以缓解IBS患者的腹痛、腹胀，改变粪便性状，而且针灸或电针治疗能降低IBS患者的内脏高敏感性[14-15]。

CGRP是目前公认的与伤害性信息传导密切相关的神经活性物质，一些研究发现存在于中枢神经系统和肠道感觉神经的CGRP在内脏疼痛的调节中起重要作用[16]，作为神经调节介质，CGRP可通过调节局部血流、平滑肌收缩、肥大细胞脱颗粒等改变内脏感觉的传入信号,这可能是导致IBS肠道动力异常和腹痛的原因。本研究结果显示，模型组大鼠结肠组织中CGRP mRNA水平较正常组显著升高，而电针治疗组则较模型组明显降低。推测认为：电针能通过对C-IBS模型大鼠结肠CGRP基因表达的调节，发挥调节神经内分泌及胃肠道运动的作用，并改善内脏敏感状态。

SP属于速激肽家族，含有11个氨基酸残基，是一种发现最早的神经肽，主要分布于肠肌间神经丛和黏膜下神经丛，储存在细的初级传入神经纤维中，在细纤维受到刺激时可在传入神经的中枢和外周端末梢释放，参与痛觉信息的传递。另一方面通过与其高亲和力受体结合对靶细胞发挥生物效应，可以调节胃肠道动力、刺激腺体的分泌、增加血管渗透性以及疼痛刺激的敏感性。本研究结果显示，模型组大鼠结肠组织中SP mRNA水平较正常组显著升高，而电针治疗组则较模型组明显降低。推测认为：C-IBS患者肠黏膜SP含量增高，可能与便秘型IBS痛觉过敏有关。电针可能以通过降低SP含量,减弱背角神经元兴奋性，从而提高内脏痛阈，消除肠道过敏。

但是CGRP和SP是否是电针治疗的主要作用途径及是否存在其他作用途径尚待进一步研究探讨证实。无疑，阐明这些问题将对电针治疗C-IBS的机制提供更多科学依据。

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