酶联免疫吸附试验检测人叶酸受体抗体IgM方法的建立及评价

杨 娜，王琳琳，袁 悦，叶荣伟，任爱国

北京大学生育健康研究所 卫生部生育健康重点实验室 北京大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系，北京100191

尽管有研究显示围产期补充叶酸可以减少神经管畸形的发生率［1-2］，但大多数新生儿神经管畸形患儿的母亲在孕期并未出现血叶酸缺乏［3-4］。叶酸受体是介导叶酸进入细胞的重要转运体，在母体胎儿叶酸传递过程中发挥重要作用。2004年，Rothenberg等［5］报道人体内的叶酸受体自身抗体与神经管畸形有关。此后，多项研究显示叶酸受体抗体可能与唇腭裂、孤独症、脑叶酸缺乏综合征等相关［6-8］，尚需要大样本量流行病学研究证实这种相关性。在进行人群研究时，需要一种可靠、高通量的叶酸受体自身抗体检测方法。目前，叶酸受体抗体的检测方法有放射性同位素标记法和酶联免疫吸附试验 (enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。放射性同位素标记法的操作复杂［5］，不适合大样本研究。目前，在ELISA检测叶酸受体自身抗体时，商品化的包被蛋白只有牛源叶酸结合蛋白，如何获得高纯度的人叶酸受体蛋白是关键。本课题组已经成功建立了从健康人胎盘中提取并纯化叶酸受体蛋白的方法［9］。本研究旨在建立ELISA检测血浆中叶酸受体自身抗体IgM的方法，并对该方法的灵敏度、精密度和稳定性进行评价。

材料和方法

叶酸受体包被 人叶酸受体的提取及纯化方法参见文献 ［9］。用PBS缓冲液 (pH 7.4)稀释从胎盘中提取的叶酸受体蛋白至5 ng/μl，4 μl/孔包被96孔酶标板，4℃过夜。含有Tween-20的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液 (tris buffered saline with tween-20，TNT)(pH 7.6，1 mol/L Tris，5 mol/L Nacl，Tween-20 0.5 ml，用双蒸水定容至1 L)洗板后，每孔加入100 μl 5%的牛血清白蛋白，孵育30 min封闭非特异位点。

标准品或样品处理 标准品或样品血浆均按1∶1比例加入活性炭，除去叶酸。目前，尚无商品化的检测叶酸受体抗体的标准品。研究显示随着年龄增长，血液中会出现某些自身抗体 (包括叶酸受体自身抗体)，并且抗体含量也会随着年龄增长变化［10］。本研究采用的叶酸受体自身抗体标准品为山西省昔阳妇幼保健院采集的健康人EDTA抗凝血浆，用TNT缓冲液稀释后叶酸受体抗体 IgM浓度分别为6.25×10－4、1.25 × 10－3、2.50 × 10－3、5.00 × 10－3、1.00 × 10－2、2.00×10－2、4.00 ×10－2和8.00 ×10－2，将原始混合血浆中叶酸受体抗体IgM浓度设定为1。阴性对照为TNT缓冲液。根据来源选择样品 (山西省昔阳妇幼保健院)的合适稀释倍数，通常用TNT缓冲液稀释80～320倍。按50 μl/孔将标准品和样品加入酶标板。标准品每个浓度设3个复孔，每个样品设两个复孔，室温下孵育18 h。

辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgM结合 用TNT缓冲液冲洗未结合的标准品或样品，加入1∶10 000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgM(北京博奥森生物技术有限公司)，室温孵育1 h。

样品检测 用TNT缓冲液和三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液 (pH 7.6，1 mol/L Tris，5 mol/L Nacl，用双蒸水定容至1 L)先后洗板，加Femto底物 (SuperSignal ELISA Femto，Thermo Scientific Pierce，美国)显色，在Synergy2多功能酶标仪 (美国Biotek公司)上检测各孔发光信号值。

数据分析 以标准品叶酸受体抗体IgM浓度的自然对数值为自变量，以发光信号值为因变量，做标准曲线，采用二次多项式拟合，得到血浆叶酸受体抗体IgM浓度的拟合方程。根据样品信号值在标准曲线上的位置得出样品中叶酸受体抗体IgM浓度。

检测限分析 以空白浓度测量值加3倍标准差表示在适当的置信水平内能从样品中检出的待测组分的最小量［11］。

精密度分析 用批内差异与批间差异表示该方法检测血浆叶酸受体抗体IgM浓度的精密度，方法参照文献 ［12-13］。对高、中、低3个不同浓度的血浆样本连续检测3批，每批每个样本设8个平行样本。

稳定性分析 对高、中、低3个不同浓度的血浆样本分别按1∶80、1∶160、1∶320稀释，测定样品的叶酸受体抗体IgM浓度。每个稀释倍数设3个平行样本。

不同包被蛋白对检测结果的影响 分别采用人叶酸受体和牛源叶酸结合蛋白作为包被蛋白，检测山西省昔阳妇幼保健院收集的24例健康新生儿母亲和20例神经管畸形患儿母亲的血浆标本，比较两种不同包被蛋白对ELISA检测血浆叶酸受体抗体IgM浓度的影响。

统计学处理 采用SPSS 20.0进行统计分析，计量资料用均数±标准差表示，计量资料均数比较用配对t检验，计量资料相关分析用Pearson相关。取双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 ELISA方法检测血浆叶酸受体抗体IgM浓度的标准曲线Fig 1 Standard curve for measuring the concentration of human IgM autoantibody to folate receptor

结 果

工作曲线 血浆叶酸受体抗体IgM浓度的拟合方程为y=1 680.2x2+27 858x+116 518，R2=0.9958。该工作曲线可测定的血浆叶酸受体抗体IgM浓度范围为6.25×10－4～8×10－2(标准品浓度为1)(图1)。

检测限 该方法能检测到的血浆叶酸受体抗体IgM浓度的最小量为3.12×10－4。

精密度 该方法检测高、中和低浓度血清叶酸受体自身抗体IgM的批内差异分别为6.61%、3.50%和5.12%(表1)。该方法检测的高、中和低浓度血清叶酸受体自身抗体IgM的浓度分别为2.13±0.10、0.90±0.05和0.50±0.03，批间差异分别为4.54%、5.49%和5.44%。

稳定性 采用此方法检测高、中、低浓度样本中叶酸受体自身抗体IgM的浓度，采用不同稀释倍数时测定值均较稳定。对于高浓度样本，稀释倍数为1∶80、1∶160、1∶320时测定值分别为1.88、1.77、1.97，在均数±10%范围内 (1.69～2.06);对于中浓度样本，稀释倍数为 1∶80、1∶160、1∶320时测定值分别为0.89、0.99、0.81，在均数 ±10%范围内 (0.81～0.98);低浓度样本80倍稀释时，3次测定值分别为0.46、0.52、0.49，在均数±10%范围内 (0.40～0.49)。稀释倍数对高、中、低浓度样本测量结果影响均较小。

包被蛋白对检测结果的影响 采用人叶酸受体包被检测板测得的健康新生儿母亲叶酸受体抗体IgM浓度为1.43±0.31，显著高于牛源叶酸结合蛋白包被检测板的测定值1.18±0.28(t=－11.9，P＜0.001)，前者的结果比后者高21%。人叶酸受体包被检测板测得的神经管畸形患儿母亲的IgM浓度为5.43±1.82，显著高于牛源叶酸结合蛋白包被检测板的测定值3.21±0.91(t=7.35，P＜0.001)，前者的结果比后者高69%。Pearson相关分析显示:不论对健康新生儿母亲还是神经管畸形患儿母亲，两种方法检测的血浆叶酸受体抗体IgM结果均相关，相关系数分别为0.944(P＜0.001)和0.779(P＜0.001)。

讨 论

本研究以人叶酸受体蛋白作为包被蛋白，成功建立了人血浆叶酸受体抗体IgM浓度的ELISA检测方法，该方法具有灵敏度高、精密度好、结果稳定的优点。此外，本研究还对ELISA检测人血浆叶酸受体自身抗体IgM浓度的方法进行了系统评价。本研究采用的发光底物Femto，靶蛋白的检测水平能达到飞克级，并且检测不同稀释倍数样品中靶蛋白浓度的测定值稳定，因此该方法的检测灵敏度高。此外，此方法检测高、中、低3种不同浓度血浆叶酸受体抗体IgM浓度的批间和批内差异均低于10%，对不同稀释倍数同一样本的测定结果的波动均在可接受范围内，表明该方法有较高的稳定性和可重复性。此方法采用化学发光法，与同位素标记法相比，具有操作简单、试剂容易获得、无放射性污染的优点。此外，Femto底物达到最大信号的孵育时间仅为1 min，适合高通量检测。因此，此方法适合实验室大样本量检测。

本研究分别采用人源叶酸受体蛋白和牛源叶酸结合蛋白包被检测板，检测人血浆叶酸受体自身抗体含量，两种方法的检测结果间有较好的相关性。牛源叶酸结合蛋白与人叶酸受体蛋白有80%的同源性，可以解释检测结果的高相关性。本研究用此方法分别检测健康新生儿母亲和神经管畸形患儿母亲的血浆叶酸受体自身抗体IgM浓度，健康新生儿母亲血浆叶酸受体自身抗体IgM水平低，神经管畸形患儿母亲血浆叶酸受体自身抗体IgM水平高。结果显示人源叶酸受体蛋白包板方法得到的测定值高于牛源叶酸结合蛋白包板方法，分别高出21%和69%，提示人源叶酸受体蛋白检测叶酸受体抗体IgM更灵敏，更能反映人血浆样本中叶酸受体自身抗体IgM的真实水平，如果用牛源叶酸结合蛋白包被检测板可能会影响检测结果。

本研究采用实验室制备的混合血浆作为标准品，这是现阶段的最佳选择，目前尚无商业化的叶酸受体抗体标准品。本研究尝试寻找更合适的叶酸受体抗体标准品，如来源于人类血清的IgM(#18260，美国Sigma公司)，由于此抗体为人混合血清，存在不同批次间差异的问题，所以相对于实验室制备的混合血浆，没有明显优势;胎盘叶酸受体蛋白2抗体 (#bs-9595R，北京博奥森生物技术有限公司)，由于此抗体仅有兔源产品，因此不适用于本研究。综合经费以及质量控制等因素，本研究选择实验室制备的混合血浆作为标准品。

由于现阶段缺乏制备叶酸受体抗体纯品的技术，所以不能对叶酸受体抗体进行绝对定量，但是对叶酸受体抗体的研究刚刚起步，相对定量值可以满足目前本领域研究的需要，即进行叶酸受体抗体与某些疾病如出生缺陷的关联研究，将病例组与对照组进行组间相对比较，寻求病因关系。

本研究的推广可以促进标准品的研发，本研究建立了一种目前可以实现的检测血浆叶酸受体抗体的方法，旨在让同领域研究者在此基础上，研究叶酸受体抗体与相关疾病的关系。如果有重要意义的研究发现，如叶酸受体抗体与某些疾病 (如出生缺陷)有关联，可以促进研究者进行叶酸受体抗体纯品制备技术的开发。

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