葡萄糖转运蛋白4基因多态性与阻塞性睡眠呼吸暂停综合征导致的低氧及相关炎症因子的关系

殷 婷，李南方，艾力根，姚晓光，洪 静，周 玲，孔剑琼

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征 (obstructive sleep apnea syndrome，OSAS)的特征是反复上呼吸道狭窄导致间歇缺氧，睡眠片段化和白天过度嗜睡［1］，氧减饱和度降低是阻塞性睡眠暂停反复低氧事件的最典型表现。有学者将OSAS称为“代谢综合症”［2］，它常合并高血压、高尿酸、高肌酐，尤其与糖代谢紊乱及低氧关系密切［3-4］。长期慢性重复间歇缺氧是胰岛素抵抗的高危因素［5］，并且这种关系独立于肥胖存在［6］。其可能机制有:间歇性缺氧引起的交感神经兴奋导致拮抗胰岛素的激素如肾上腺素水平增高［7］。此外，OSAS患者夜间间歇低氧和再氧合是诱导氧化应激的关键因素，间歇低氧和再氧合导致活性氧 (reactive oxygen species，ROS)和炎症因子［8］高表达，进而引发OSAS炎症级联反应［9］。ROS通过减少胰腺β细胞中的抗氧化酶数量，直接导致胰腺细胞功能受损［10］。低氧通过影响炎症核心因子-核因子κB信号通路，降低单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)分泌水平［11］。对低氧刺激敏感的经典炎症因子肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)引发糖代谢紊乱的重要因素与分布于脂肪、骨骼肌和心肌组织细胞内的葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)表达减少以及其转位障碍密切相关［12］。GLUT4是人和啮齿动物最主要的胰岛素敏感型葡萄糖运输载体［13］。GLUT4动物模型研究证实:低氧可以削弱GLUT4电活动，导致葡萄糖的可用性减少，从而引发糖代谢紊乱［14］。有研究证实GLUT4基因与OSAS相关［15］。慢性间歇性缺氧似乎对特定基因组的影响不同［15-16］。因此，本研究通过测序筛查GLUT4基因代表性变异位点，旨在分析OSAS导致的低氧表现和严重程度是否与GLUT4易感基因多态性及相关炎症因子有关。

对象和方法

对象 选取2010年1至12月新疆自治区人民医院高血压科随机连续入院患者，排除严重颌面部畸形、长期严重酗酒、哮喘、支气管扩张、甲状腺疾病、慢性阻塞性肺疾病、心力衰竭、原发性醛固酮增多症、2种降压药不能控制的难治性高血压、精神心理疾病、近6个月内出现急性心脑血管性疾病、严重心肝肾疾病、急性期感染、恶性肿瘤、脑卒中、有上呼吸道手术史、胰腺手术史及正在进行持续正压通气治疗的患者，以及已经确诊的2型糖尿病或正在服用降糖药物的患者。纳入睡眠打鼾、夜间呼吸暂停伴有白天易嗜睡以及其他原因不明的唇舌、甲床发绀，红细胞和血红蛋白水平增高患者。

OSAS诊断依据及严重程度参考2011年修订版《阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征诊治指南》［16-17］:无OSAS，睡眠呼吸紊乱指数 (apnea hypopnea index，AHI) ＜5次/h;轻度，5次/h＜AHI≤15次/h;中度，15次/h＜AHI≤30次/h;重度，AHI＞30次/h。低氧血症程度判断依据:无低氧血症，最低动脉血氧饱和度 (arterial oxygen saturation，SaO2)≥90%;轻度，85%≤最低SaO2＜90%;中度，80%≤最低SaO2＜85%;重度，最低SaO2≤79%。

符合入选标准的共896例，完成整夜多导睡眠监测 (polysomnography，PSG)及血清炎症因子测定的共859例 (男性596例、女性263例)，616例 (男性462例、女性154例)诊断为OSAS伴中重度低氧血症(病例组)，243例 (男性134例、女性109例)排除OSAS及低氧血症 (对照组)。本研究经新疆维吾尔自治区伦理委员会、自治区卫生厅及新疆维吾尔自治区人民医院批准，研究对象均签署知情同意书。

资料收集 病史采集由主管医师完成，收集年龄、性别、民族、身高、体质量、腰围、心率、血压等一般资料，以及诊断或正在治疗的高血压、高胆固醇血症、糖尿病病史资料，计算体质量指数 (body mass index，BMI)=体重 (kg)/身高2(m2)。

PSG 采用澳大利亚康迪E系列PSG系统进行夜间连续7 h睡眠监测。监测前72 h禁止服用镇静和肌松药物，检查当天禁止服用咖啡因、镇静剂、催眠药及饮酒。PSG包括二导联脑电图 (C3-A2，C4-A1)、二导联眼动图、下颌肌电图、口鼻气流、胸腹运动、体位、脉搏、心电图、SaO2、鼾声、体位及左右腿动等项目，由专业医师判读分析数据。依据脑电图记录，对睡眠效率＜50%的患者重复进行PSG。平均氧减饱和度下降幅度 (mean oxyhemoglobin desaturation degree，mODD)为睡眠期间SaO2下降幅度的平均值，血氧饱和度低于90%累计时间比 (cumulative percentage of time spent below oxygen saturation of 90%，TS90%)为血氧饱和度低于90%的累计时间占总监测时间的百分比，氧减饱和度面积=平均SaO2下降幅度×低氧血症时间/睡眠总时间×100%，氧减指数 (oxygen desaturation index，ODI)=睡眠中平均每小时发生氧减饱和度下降的次数，ODI3、ODI4和ODI5分别为每小时睡眠中氧减饱和度下降3%、4%和5%的次数，氧减饱和度事件累积时间比率 (cumulative time percentages of oxyhemoglobin desaturation events，DCT)为睡眠期间氧减饱和度事件累积时间占总睡眠时间的百分比。

血清炎症因子测定 采集受试者清晨空腹外周静脉血5 ml，加入0.2 μl抑肽酶，离心分离血清。采用乳胶增强免疫比浊法测定血清高敏C反应蛋白 (highsensitivity C-reactive protein，hs-CRP)浓度，放射免疫法检测血清TNF-α、IL-6、MCP-1水平，检测试剂盒由北京北方生物技术研究所提供。

GLUT4基因测序及多态性分析 选取96例 (男性84例、女性12例)无亲缘关系伴有中重度低氧血症的 OSAS患者，采用PAXgene Blood DNA试剂盒(QIAGEN，Hilden，德国)提取基因组 DNA，分析GLUT4基因所有外显子和启动子区序列 (3100XL基因分析仪，Applied Biosystems，加利福尼亚，美国)。在最小等位基因频率＞5%的常见变异位点中，采用连锁不平衡分析 (r2＞0.8)选择代表性单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism，SNP)位点。

采用TaqMan-PCR(PRISM 7900实时荧光定量PCR仪，ABI公司，沃灵顿，英国)859例患者进行基因型鉴定。TaqMan-PCR反应体系:总混和液2.25 μl，引物 0.125 μl，DNA 1.0 μl，加去离子水至 5 μl;反应条件:95℃预变性10 min，43个循环 (95℃变性15 s，60℃退火1 min，71℃延伸1 min)，最后72℃延伸7 min。应用Data Analysis软件 (ABI公司)进行等位基因型分析。基因分型质量控制措施如下:每个384孔板均设有空白对照、阳性对照，并随机分布病例、对照样本。基因分型的读取率＞98%，重复检测的一致率为100%。从美国应用生物系统网站 (http://appliedbiosystems.com)获取TaqMan-PCR基因分型探针和引物信息。

统计学处理 采用HNE软件 (ABI公司，美国)监测基因型、等位基因频率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡;SNPalyzer软件 (ABI公司)分析该人群的特异性SNPs位点及变异位点间的连锁不平衡关系，计算基因型频率。按照血糖水平将OSAS患者分为糖尿病、空腹血糖受损和糖耐量受损3组，比较血糖水平与OSAS患者低氧水平关系。糖尿病的诊断标准为:空腹血糖≥7.0 mmol/L，或75 g口服葡萄糖耐量试验，葡萄糖负荷2 h后的血糖≥11.1 mmol/L。空腹血糖受损的诊断标准为:空腹血糖6.1～＜7.0 mmol/L，75 g口服葡萄糖耐量，葡萄糖负荷2 h后的血糖＜11.1 mmol/L。糖耐量受损的诊断标准为:75 g口服葡萄糖耐量试验，7.8 mmol/L≤葡萄糖负荷2 h后的血糖＜11.1 mmol/L。采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，满足正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，否则用中位数 (四分位数)表示。正态分布计量资料组间差异的比较采用独立样本t检验和One-Way ANOVA分析，非正态分布计量资料采用Mann-Whitney test秩和检验;Hardy-Weinberg平衡分析及4个表资料采用χ2检验。比值比 (odd ratio，OR)判定及混杂因素校正采用Logistic回归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 临床资料在对照组及病例组的比较 (±s)Table 1 Comparisons of basic characteristics of subjects in control and case groupss)

表1 临床资料在对照组及病例组的比较 (±s)Table 1 Comparisons of basic characteristics of subjects in control and case groupss)

1 mmHg=0.133 kPa;DBP:舒张压;SBP:收缩压;BMI:体质量指数;TC:总胆固醇;HDL-C:高密度脂蛋白胆固醇;LDL-C:低密度脂蛋白胆固醇;TG:甘油三酯;AHI:睡眠呼吸紊乱指数;mODD:平均氧减饱和度下降幅度;DCT:氧减饱和度事件累积时间比率;ODI3:每小时睡眠中氧减饱和度下降3%的次数;ODI4:每小时睡眠中氧减饱和度下降4%的次数;ODI5:每小时睡眠中氧减饱和度下降5%的次数1 mmHg=0.133 kPa;DBP:diastolic blood pressure;SBP:systolic blood pressure;BMI:body mass index;TC:total cholesterol;HDL-C:high density lipoprotein cholesterol;LDL-C:low density lipoprotein cholesterin;TG:triglyceride;AHI:apnea hyponea index;mODD:mean oxyhemoglobin desaturation degree;DCT:cumulative time percentags of oxyhemoglobin desaturation events;ODI3:oxygen desaturation index of 3;ODI4:oxygen desaturation index of 4;ODI5:oxygen desaturation index of 5

value性别 (男/女)Sex(male/female)(n)检测指标Detection index 对照组Control group 病例组Case group P值P 001 134/109 462/154 ＜0.001年龄 (岁)Age(year) 54.8± 11.2 48.2± 9.9 ＜0.001 DBP(mmHg) 121.4± 18.9 140.0±19.5 ＜0.001 SBP(mmHg) 75.6± 14.3 94.5±14.5 ＜0.001 BMI(kg/m2) 23.5± 2.8 28.5± 3.6 ＜0.001腹围Abdomen circumference(cm) 87.9± 8.2 101.0±9.6 ＜0.001血红蛋白Hemoglobin(pg) 30.0± 1.9 30.5±1.9 ＜0.019尿酸 Uric acid(μmol/L) 258.9±100.2 361.3±90.0 ＜0.001血糖Blood glucose(mmol/L) 5.0± 1.1 5.3±1.4 ＜0.001 TC(mmol/L) 3.6± 1.6 4.6± 0.9 ＜0.001 HDL-C(mmol/L) 1.3± 0.4 1.1± 0.3 ＜0.001 LDL-C(mmol/L) 2.6± 0.9 2.5±0.7 0.569 TG(mmol/L) 2.4± 2.0 2.3±1.5 0.253 AHI 3.7± 14.2 27.6±29.1 ＜0.001睡眠效率Sleep efficiency(%) 70.4± 18.1 72.3±13.6 0.373最低血氧饱和度Lowest oxygen saturation(%) 89.8± 6.8 73.7±10.7 ＜0.001平均心律 (次/min)Average heart rate(number/min) 66.6± 8.9 66.7±8.5 0.950最小心律 (次/min)Minimum heart rate(number/min) 80.4± 11.2 82.2±10.9 0.260 mODD(%) 5.3± 4.8 17.4± 8.9 ＜0.001 DCT(%) 0.1± 0.1 0.22± 0.2 ＜0.001 ODI3(number/h) 7.6± 6.8 14.0± 8.7 ＜0.001 ODI4(number/h) 2.9± 4.0 9.3± 7.1 ＜0.001 ODI5(number/h) 6.5± 21.5 29.8±24.9 ＜0.001血氧饱和度低于90%的累计时间Time spent below oxygen saturation of 90% (h) 0.8± 4.5 4.7±6.6 ＜0.001氧减饱和度面积Oxygen desaturation area 0.8± 4.5 4.6±6.6 ＜0.

结 果

一般资料 在高血压专科入院患者中，OSAS合并中重度低氧血症的比例为72%。病例组与对照组比较，在性别构成、年龄、血压、BMI、腹围、血糖、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、AHI、最低SaO2、ODI、mODD、血氧饱和度低于90%的累计时间和氧减饱和度面积方面的差异有统计学意义 (P均＜0.05)(表1)。

GLUT4基因测序结果 在96例OSAS伴中重度低氧血症患者GLUT4基因的外显子和启动子区共发现4个SNP位点，分别为rs5415、rs5417、rs5418和rs5435，其中rs5417和rs5415完全连锁 (表2)。根据连锁不平衡分析r2＞0.8和最小等位基因频率＞5%，最终确定3个代表性SNP位点rs5415、rs5417和rs5435在大样本中进行基因分型鉴定。

GLUT4基因分型 在859例研究对象中，GLUT4基因rs5415位点成功分型852例，rs5417成功分型844例，rs5435成功分型842例。分别在总人群中和亚组中分析4种基因模型 (包括等位基因模型、基因型、显性模型和隐性模型)在两组中的分布。在年龄≥50岁人群中，GLUT4基因SNP位点rs5417的基因型、等位基因模型和隐形模型在病例组和对照组间的分布频率差异有统计学意义 (P均 ＜0.05)。在 BMI≥24 kg/m2人群中，该位点在两组间的基因型分布频率差异有统计学意义 (P＜0.05)。而不论在总人群还是亚组人群中，rs5415和rs5435位点4种基因模型在病例组和对照组间的分布频率差异均无统计学意义 (P均 ＞0.05)(表3)。

Logistic回归模型校正导致低氧的混杂因素 将SNP位点rs5417的隐性模型 (AA+AC=1，CC=0)放入方程，校正影响引起OSAS患者低氧的混杂因素性别、年龄、BMI、血脂、血糖后，GLUT4基因SNP位点rs5417的AA+AC为影响OSAS患者低氧的独立保护因素 (OR=0.071，95%CI=0.045～0.113，P＜0.001)，为去除AC的影响，再次将该位点基因型模型放入方程，rs5417位点的基因型AA仍为影响OSAS患者低氧的独立保护因素 (OR=0.385，95%CI=0.210～0.704，P=0.002)。男性 (OR=1.635，95%CI=1.037～2.577，P=0.034)和总胆固醇 (OR=1.600，95%CI=1.287～1.987，P＜0.001)是 OSAS患者低氧的独立危险因素，正常体质量 (OR=0.059，95%CI=0.037～0.094，P＜0.001)和高密度脂蛋白胆固醇 (OR=0.337，95%CI=0.171～0.666，P=0.002)为OSAS低氧的独立保护因素。

GLUT4基因rs5417多态性位点隐性模型与相关炎症因子和睡眠参数表型的关系 在GLUT4基因SNP位点rs5417的隐性模型中，AA+AC基因型OSAS患者低氧者的比例为69.1%，低于CC基因型携带者低氧者的比例 (74.7%)。MCP-1、CRP以及DCT、TS90%、氧减饱和度面积在CC基因型组和AA+AC基因型组间的差异有统计学意义 (P均＜0.05)(表4)。

OSAS患者血糖水平与低氧程度关系 随着血糖水平增高，OSAS患者的AHI水平越高，最低SaO2越低，mODD越大，ODI3、ODI4、TS90%和氧减饱和度面积越大 (图1)。

表2 96例OSAS伴中重度低氧血症患者GLUT4基因的外显子和启动子序列的变异位点Table 2 Mutation sites of GLUT4 gene exon and promoter sequences in 96 OSAS patients with moderately severe hypoxemia

讨 论

OSAS是继发性高血压的主要原因之一，夜间低氧是血压变异性增加的主要原因［17-18］。在继发性高血压患者中，OSAS患者的比例最高［18-19］。因此，在高血压患者中筛查OSAS，能提高受试对象的检出率，提高样本量和研究结果的代表性。本研究从研究人群中随机选择中重度低氧血症OSAS患者96例，其最低SaO2水平从22%到84%，这些患者基因组中的变异位点是对低氧敏感的易感位点。研究显示OSAS患者夜间低氧与GLUT4基因SNP位点rs5417相关，该位点的A等位基因相对于C的低氧程度明显减轻，这种差异出现在年龄≥50岁和超重肥胖人群中。

男性、老龄、肥胖、上气道解剖学异常以及长期酗酒是OSAS的易患因素，与本研究的结果一致。有研究显示OSAS多发于青壮年男性［19-20］，本研究显示年龄大于50岁是OSAS的独立危险因素，两者结果不一致可能与老年打鼾患者就医意识增强、在OSAS筛查人群中所占比率增高有关。

表3 GLUT4基因多态性不同模型在对照组及病例组分布频率的比较［n(%)］Table 3 Distribution frequencies of GLUT4 gene polymorphisms in the control and case groups［n(%)］

睡眠过程中间断缺氧发作和间断再复氧是OSAS引起交感神经兴奋、内皮功能障碍、炎症和胰岛素抵抗的病理生理学基础［20-21］。SaO2下降是睡眠呼吸暂停的最直接表现，低氧也是OSAS导致多数器官损害的核心［21-22］。评价OSAS患者机体低氧的指标主要包括幅度性、时长性、频率性及面积指标4类，本研究选用多种低氧指标综合评价患者低氧情况，主要有ODI3、ODI4、TS90%、DCT和血氧饱和度下降幅度等，研究显示OSAS患者低氧程度越重，AHI水平越高，空腹血糖紊乱程度越重，且图1中低氧指标与AHI的变化趋势一致。此外，对照组重复空腹血糖≥6.1 mmol/L的比例为3.8%，病例组重复空腹血糖≥6.1 mmol/L的比例达16.2%，低氧患者糖代谢紊乱的检出率远高于对照组。

续表3

GLUT4是SLC2家族膜转运体超家族促进者的重要成员，介导葡萄糖进入细胞。GLUT4易位损害是导致葡萄糖转移减低、引起2型糖尿病的主要因素［22-23］。胰岛素或者肌肉收缩/缺氧主要通过调节GLUT4从细胞内室向等离子体膜和横小管上易位，影响葡萄糖运输［23-24］。低氧刺激可以诱导心肌和比目鱼肌肉(骨骼肌)GLUT4基因表达［24-25］。腺苷酸活化蛋白激酶 (adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)的级联反应是细胞的能量开关，与维持细胞内高ATP∶ADP密切相关。低氧刺激使细胞内ATP含量减低，激活PI3Kγ-AKT-AS160通路，影响骨骼肌GLUT4易位及葡萄糖摄取［25-26］。GLUT4介导的葡萄糖转运是骨骼肌中糖代谢的主要限速步骤［26-27］。动物实验显示，低氧刺激导致AMPK活性改变，并减少GLUT4内吞活动［27-28］。GLUT4分子内吞活动减弱与骨骼肌基底功能和胰岛素刺激葡萄糖摄取能力减低有关［28-29］，导致胰岛素敏感性下降及葡萄糖代谢不良。AMPK级联反应是连接低氧和糖代谢紊乱的重要信号通路之一，最低SaO2与胰岛素抵抗指数呈负相关［29-30］，葡萄糖稳态与OSAS导致的急性和长期慢性缺氧有关，且胰岛素抵抗和葡萄糖耐受不良的严重程度与间歇性低氧呈正相关［30-32］。间歇低氧通过调节基因编码，影响GLUT4和糖酵解酶［32-33］，引起GLUT4囊泡在胰岛素刺激后沿着微观和肌动蛋白细胞骨架网络动态重构过程障碍［33-34］，使GLUT4分子不能运载细胞外葡萄糖进入细胞内，导致细胞外高血糖状态，细胞外高血糖状态是低氧引起糖代谢紊乱的连锁反应之一。

表4 GLUT4基因rs5417位点隐性模型不同基因型携带者炎症因子与睡眠参数表型的比较Table 4 rs5417 GLUT4 gene loci implicit model different genotype carriers in the phenotype of inflammatory factor and the sleep parameters

图1 OSAS患者血糖水平与低氧程度关系Fig 1 Relationship between degree of the low oxygen and blood glucose level among OSAS patients

夜间间歇低氧和复氧导致机体氧化应激和产生ROS增加［34-35］，ROS水平增高引起黏附因子，尤其是MCP-1高表达［8］，体内和体外研究均证实，MCP-1具有单核细胞趋化活性，能激活单核细胞和巨噬细胞，使其胞浆Ca2+浓度升高、产生和释放超氧阴离子，引起炎症因子 TNF-α、IL-6 水平增高［35-36］。TNF-α、IL-6是合成血清CRP重要的调节因子，经持续气道正压通气治疗后，OSAS患者的 CRP和 IL-6水平明显下降［36-37］。因此，本研究选择对机体缺氧敏感的3种炎症因子和血清炎症标记物—CRP作为低氧效应指标，结果显示GLUT4基因rs5417位点AA+AC基因型携带者血清MCP-1和CRP水平低于CC基因型携带者。电泳迁移率变动分析显示，MCP-1通过调节核因子-κB的结合活性，诱导人体炎症反应［37-38］。MCP-1能够诱导肌动蛋白聚合并上调肌动蛋白聚合受体亲和力［38-40］，而纤维状肌动蛋白是触发GLUT4囊泡易位的基础［40-41］。本研究推测OSAS患者长期慢性缺氧引起机体炎症状态，导致MCP-1水平增高，影响GLUT4分子对葡萄糖的正常运载作用，进一步加重糖代谢紊乱。在GLUT4基因rs5417位点隐性模型中血清TNF-α和IL-6水平的差异无统计学意义，可能由于该研究入选人群存在高血压患者且易合并其他代谢紊乱表现，导致这类人群机体处于微炎症状态，TNF-α和IL-6是机体慢性炎症性疾病经典的炎症反应因子，无法与OSAS引起的炎症区别。今后将对这些受试者进行定期随访和有效干预，科学评估OSAS患者的糖代谢紊乱程度以及相关炎症因子水平的动态变化，以期找到有效控制病情恶性循环的切入点，为改善OSAS患者生活质量和减少心血管并发症提供依据。

综上，从遗传易感性角度看，OSAS引起的夜间低氧与GLUT4基因SNP位点rs5417相关，多项低氧指标的变化趋势与AHI一致。OSAS导致的夜间间歇低氧通过干扰人体内复杂细胞通路的调节造成GLUT4基因表观遗传学改变，并影响对低氧敏感的MCP-1和CRP水平。

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