载脂蛋白A1基因rs670和rs5069多态性对不同体质量指数青少年血脂的影响

宋永砚，龚仁蓉，张 珍，李元昊，樊 梅，欧国进，方定志

1四川大学 华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室，成都610041

2川北医学院 基础医学院生物化学教研室，四川南充637007

载脂蛋白A1(apolipoprotein A1，APOA1)是高密度脂蛋白 (high-density lipoprotein，HDL)的主要载脂蛋白，参与HDL的代谢调节。APOA1基因内的遗传多态性对该基因的表达及血脂水平均有影响。APOA1基因内部含有多个变异位点，rs670(－75 G/A)多态性位点位于APOA1基因启动子区域，研究显示次要等位基因A与血浆APOA1［1-4］、高密度脂蛋白胆固醇 (high-densitylipoprotein cholesterol，HDLC)［3-7］、低密度脂蛋白胆固醇［8-9］和总胆固醇［8-9］水平升高相关联。rs5069(+83C/T)多态性位于APOA1基因的第一内含子，研究显示次要等位基因T与血浆APOA1［1，4，8］、HDL-C［4-6］和总胆固醇［8］水平升高相关联。有关APOA1基因rs670和rs5069多态性对血脂水平的影响，以往研究绝大多数均在中老年人群中进行，较少有研究去探讨这两个变异位点对儿童和青少年血脂水平的影响。但是，脂代谢紊乱不仅是成年人心血管病的危险因素，它也以同样的方式导致儿童和青少年血管内膜脂质条纹的形成和动脉粥样硬化的发生和发展［10］。因此，探讨APOA1基因rs670和rs5069多态性对儿童和青少年血脂水平的影响对该人群心血管病的防治具有重要意义。

对象和方法

对象 选取四川省都江堰市中学生723人，其中女生407人、男生316人，年龄15～18岁，平均(16.86±0.59)岁。参试对象在纳入前进行体检并填写健康调查问卷，排除有慢性消耗性疾病史或心脑血管疾病史的青少年，排除正在服用可影响糖脂代谢药物以及激素类药物的青少年。参试对象在纳入前均签署知情同意书。研究群体的甘油三酯 (triglycerides，TG)水平为(991.85±391.00)mg/L，总胆固醇(total cholesterol，TC)为(1 388.75 ±220.65)mg/L，低密度脂蛋白胆固醇水平为(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)为 (645.46±189.20)mg/L，HDL-C为(544.91±107.59)mg/L，血糖为(912.80±78.50)mg/L。

一般资料的收集 包括身高、体质量、腰围、臀围、血压等。所有测量按常规方法进行。按体质量/身高2(kg/m2)计算体质量指数(body mass index，BMI)，按腰围/臀围计算腰臀比。

实验分组 采用四分位数分组法对研究群体BMI进行分组，从小到大分为4组。各组人数及BMI水平分别为:1组180人，BMI(17.80±0.75)kg/m2;2组182人，BMI(19.39±0.32)kg/m2;3组181人，BMI(20.68±0.43)kg/m2;4组180人，BMI(23.40±2.05)kg/m2。

血脂及血糖测定 采血前24 h内限制高脂饮食，不饮酒，不做剧烈体力活动。于早上7点之前采集空腹静脉血5 ml，分成两份，一份用于制备血浆测定血脂浓度，另一份用于提取基因组DNA。血脂测定采用浙江东瓯诊断产品有限公司的酶法测定试剂盒，具体操作严格按试剂盒说明书进行。所有指标测定重复3次。

APOA1 rs670和rs5069多态性分析

DNA提取:从外周血白细胞中提取基因组DNA，采用天根生化科技公司的血液基因组提取试剂盒进行提取，具体操作过程严格按试剂盒说明书进行。

PCR扩增:PCR扩增含有APOA1 rs670和rs5069多态性位点的DNA片段。引物序列由上海生物工程有限公司合成，正向引物为5’-AGGGACAGAGCTGATCCTTGAACTCTTAAG-3’，反向引物为 5’-TTAGGGGACACCTAGCCCTCAGGAAGAGCA-3’。PCR反应体系 (25 μl)中含有DNA模板1 μg，上游和下游引物各0.8 μmol/L，dNTP各200 μmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U。PCR扩增包括:95℃预变性5 min;95℃变性30 s，58℃退火40 s和72℃延伸40 s，共35次循环;72℃延伸5 min。

限制性核酸内切酶分析:MspI酶切反应体系 (10 μl):1 μl 10 × 限制性内切酶缓冲液与 7 μl ddH2O充分混匀后，加入2 μl PCR扩增产物和5 U MspI内切酶。1 000 r/min瞬时离心30 s(转子半径为7.5 cm)，37℃水浴中酶切16 h。3%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统显色鉴定各组样本的基因型。

统计学处理 采用SPSS 11.5软件进行统计分析。所有数据采用均数±标准差表示。不符合正态分布的计量资料 (如TG)进行对数转换后纳入统计分析。采用 χ2检验比较BMI各组之间基因型及等位基因频率的差异。采用One-way ANOVA检验比较BMI组内不同基因型之间计量资料的差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 APOA1 rs670和rs5069多态性MspI酶切后的电泳图谱Fig1 Electrophoresis map of the DNA fragments containing the rs670 and rs5069 polymorphism sites of APOA1 after digestion by MspI

结 果

APOA1 rs670和rs5069位点在研究群体中的基因型及等位基因频率 rs670位点位于APOA1基因的启动子区域，rs5069位点位于APOA1基因的第一内含子，对包含这两个多态性位点的DNA区域进行PCR扩增，扩增片段总长度为434 bp。被扩增的DNA片段上含有3个MspⅠ酶切位点，包括两个多态性位点(rs670位点和rs5069位点)和1个固有切点。rs670多态性由G(鸟嘌呤)变异成A(腺嘌呤)生成，G为主要等位基因，A为次要等位基因。G所在的核苷酸短序列可被限制酶MspⅠ识别和切割 (5’-C↓CGG-3’)，而A不能。酶切后的电泳图谱上，GG基因型含有113和67 bp两个片段，GA基因型含有180、113和67 bp 3个片段，AA基因型仅含180 bp的片段。rs5069多态性由C(胞嘧啶)变异成T(胸腺嘧啶)产生，C为主要等位基因，T为次要等位基因。C构成的核苷酸短序列可被限制酶MspⅠ识别和切割，而T不能。酶切后的电泳图谱上，CC基因型含有209和45 bp两个片段，CT基因型含有254、209和45 bp 3个片段，TT基因型仅含254 bp片段 (图1)。

APOA1 rs670位点基因型频率 (χ2=0.446，P=0.931)及等位基因频率 (χ2=1.005，P=0.800)在BMI各组差异无统计学意义;APOA1 rs5069位点基因型频率 (χ2=0.336，P=0.953)及等位基因频率(χ2=0.405，P=0.939)在BMI各组差异亦无统计学意义 (表1)。

APOA1 rs670多态性对不同BMI青少年生理生化指标的影响 1、2和3组中所有指标在不同基因型青少年之间差异均无统计学意义。4组除A等位基因携带者的收缩压 (P=0.017)和血糖水平 (P=0.009)显著高于GG基因型参试者外，其他指标差异均无统计学意义 (表2)。

APOA1 rs5069多态性对不同BMI青少年生理生化指标的影响 1、2和3组中所有指标在不同基因型青少年之间差异均无统计学意义。4组中除T等位基因携带者的身高 (P=0.013)、体质量 (P=0.011)和臀围 (P=0.026)显著高于CC基因型参试者外，其他指标差异均无统计学意义 (表3)。

表2 不同BMI组中APOA1 rs670多态性不同基因型青少年生理生化指标的比较 ±s)Table 2 Physiological and biochemical indicaters of the adolescents with different APOA1 rs670 genotypes in the four different BMI groups±s)

表2 不同BMI组中APOA1 rs670多态性不同基因型青少年生理生化指标的比较 ±s)Table 2 Physiological and biochemical indicaters of the adolescents with different APOA1 rs670 genotypes in the four different BMI groups±s)

分组Group 年龄 (岁)Age(year)身高Height(cm)体质量Body mass(kg)BMI(kg/m2)腰围Waist circumference(cm)臀围Hip circumference(cm)腰臀比Waist to hip ratio收缩压Systolic blood pressure(mmHg)1组Group 1 GG基因型参试者GG genotype(n=95)16.89±0.57 164.38±6.98 48.07±4.45 17.76±0.78 64.64±3.45 85.50±2.90 0.76±0.03 116.70±11.55 A等位基因携带者A carriers(n=85)16.81±0.57 163.05±7.47 47.53±4.53 17.84±0.71 64.56±3.54 85.69±3.06 0.75±0.03 118.29±12.11 P值P value 0.331 0.220 0.419 0.468 0.883 0.666 0.670 0.369 2组Group 2 GG基因型参试者GG genotype(n=102)16.97±0.62 163.83±8.10 52.28±5.25 19.43±0.31 67.72±3.14 88.63±3.12 0.76±0.03 120.41±11.72 A等位基因携带者A carriers(n=80)16.88±0.53 162.25±7.35 51.05±4.64 19.35±0.33 67.44±3.57 88.64±2.74 0.76±0.04 119.80±12.39 P值P value 0.276 0.176 0.101 0.120 0.571 0.977 0.576 0.734 3组Group 3 GG基因型参试者GG genotype(n=98)16.83±0.05 159.88±7.15 53.01±4.74 20.70±0.39 70.26±3.25 89.56±2.54 0.78±0.03 116.90±12.50 A等位基因携带者A carriers(n=83)16.83±0.05 160.77±8.48 53.50±5.51 20.65±0.45 70.78±3.70 90.00±3.16 0.78±0.03 118.68±11.32 P值P value 0.955 0.445 0.521 0.451 0.314 0.296 0.690 0.321 4组Group 4 GG基因型参试者GG genotype(n=96)16.80±0.60 158.80±7.63 59.06±8.08 23.34±1.98 76.37±6.66 93.70±4.74 0.81±0.04 117.39±10.72 A等位基因携带者A carriers(n=84)16.85±0.63 158.60±7.32 59.25±8.76 23.46±2.12 76.61±6.30 93.90±5.03 0.81±0.04 121.44±11.88 P值P value 0.641 0.855 0.885 0.687 0.808 0.787 0.8640.017

续表2

表3 不同BMI组中APOA1 rs5069多态性不同基因型青少年生理生化指标的比较 ±s)Table 3 Physiological and biochemical indicators of the adolescents with different APOA1 rs5069 genotypes in the four different BMI groups(±s)

表3 不同BMI组中APOA1 rs5069多态性不同基因型青少年生理生化指标的比较 ±s)Table 3 Physiological and biochemical indicators of the adolescents with different APOA1 rs5069 genotypes in the four different BMI groups(±s)

分组Group 年龄 (岁)Age(year)身高Height(cm)体质量Body mass(kg)BMI(kg/m2)腰围Waist circumference(cm)臀围Hip circumference(cm)腰臀比Waist to hip ratio收缩压Systolic blood pressure(mmHg)1组Group 1 CC基因型参试者CC genotype(n=153)16.84±0.57 163.63±7.23 47.73±4.55 17.79±0.74 64.59±3.39 85.59±3.05 0.75±0.03 117.81±11.92 T等位基因携带者T carriers(n=27)16.96±0.51 164.42±7.30 48.28±4.14 17.84±0.79 64.69±4.03 85.58±2.52 0.75±0.03 115.40±11.15 P值P value 0.290 0.602 0.557 0.733 0.890 0.987 0.856 0.330 2组Group 2 CC基因型参试者CC genotype(n=158)16.93±0.60 163.10±8.12 51.73±5.23 19.40±0.32 67.66±3.44 88.65±3.04 0.76±0.04 120.26±12.25 T等位基因携带者T carriers(n=24)16.92±0.40 163.36±5.33 51.78±3.35 19.38±0.30 67.22±2.54 88.55±2.32 0.75±0.03 119.33±10.29 P值P value 0.915 0.880 0.965 0.853 0.552 0.876 0.6280.724

续表3

讨 论

APOA1存在于HDL中，是HDL的主要载脂蛋白。HDL的主要功能是将外周胆固醇逆向转运至肝，转变成胆汁酸盐排出体外。除了参与胆固醇逆向转运外，HDL在体内还具有抗炎、抗氧化、抗栓塞等生理功能［11-12］。血浆胆固醇水平升高是心血管病的主要危险因素，HDL通过胆固醇逆向转运而降低血浆胆固醇水平，因此具有抗动脉粥样硬化的作用。研究显示血浆HDL水平降低伴随心血管病发病风险增高［13-14］。

APOA1的功能是激活卵磷脂－胆固醇酯酰转移酶，卵磷脂－胆固醇酯酰转移酶被激活后催化游离胆固醇酯化成胆固醇酯，胆固醇酯进入新生盘状HDL内核，HDL逐渐成熟变成球状颗粒。APOA1基因上含有多个遗传变异位点，其中位于启动子区的rs670位点和位于第一内含子的rs5069位点研究较多。研究显示，APOA1 rs670和rs5069多态性与血浆APOA1、HDL-C、低密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇水平存在相关性，但报道结果不尽一致［1-9］。Wang等［6］在143例成年高加索人种中，发现rs670位点A等位基因和rs5069位点T等位基因均可显著升高血浆HDL-C水平;在100例儿童高加索人种中，rs5069多态性与HDL-C水平具有显著相关性，但rs670多态性与HDL-C水平无相关性。在欧洲的一项研究中，研究人员发现无论在男性还是女性中，rs670位点A等位基因均可显著升高APOA1和HDL-C的血浆水平，而且不受地理区域和语言的影响［3］。在我国汉族人群中，Zou等［4］研究显示 rs670位点A等位基因和rs5069位点T等位基因可显著升高血浆APOA1和HDL-C水平。在本研究的所有组别中，均未发现血浆脂质水平与APOA1 rs670和rs5069多态性存在相关性，这可能跟本研究群体的年龄结构特点有关。以往的相关研究绝大多数是在中老年人群中进行，而本研究的对象为青少年，年龄在15～18岁，平均 (16.86±0.59)岁。儿童和青少年的脂代谢较为稳定，不易受遗传变异的影响。

本研究rs670多态性不同基因型青少年的生理生化指标在1、2和3组中差异均无统计学意义，4组A等位基因携带者的血糖水平和收缩压显著高于GG基因型青少年。Chen等［15］研究显示 APOA1 rs670多态性与收缩压显著相关，Logistic回归分析显示G等位基因是升高收缩压的危险因素。但在另一项研究中，未发现APOA1 rs670多态性与血压存在相关性［16］。本研究在BMI较高的青少年中，A等位基因携带者收缩压显著升高。APOA1 rs670多态性与血压的相关性有待进一步阐明。本研究显示在BMI较高的青少年中A等位基因携带者的血糖水平显著高于GG基因型青少年。

rs5069多态性不同基因型青少年的生理生化指标在1、2和3组中差异均无统计学意义，4组T等位基因携带者的身高、体质量和臀围显著高于CC基因型青少年。Chen等［15］在2型糖尿病人群中发现rs5069多态性与BMI和腰臀比相关，C等位基因携带者BMI和腰臀比显著升高。本研究在BMI较高的青少年中，T等位基因携带者的身高、体质量和臀围显著高于CC基因型青少年。rs5069位点存在于APOA1基因的第一内含子内，该多态性位点不是影响身高、体质量及臀围等人体测量指标的功能性变异，很可能与其他影响人体测量指标的功能性变异连锁不平衡。

综上，在青少年群体中，APOA1 rs670多态性A等位基因与收缩压和血糖水平升高相关联，但这种关联性仅在BMI较高的青少年中出现，具体机制尚有待于进一步研究。

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