维药阿育魏实总黄酮抗氧化活性研究

张 慧，章立华，黄 琼，热娜·卡斯木

(新疆医科大学药学院，新疆乌鲁木齐 830011)

维药阿育魏实总黄酮抗氧化活性研究

张 慧，章立华，黄 琼，热娜·卡斯木*

(新疆医科大学药学院，新疆乌鲁木齐 830011)

[目的]评价阿育魏实总黄酮的抗氧化能力。[方法]采用羟自由基、超氧阴离子自由基、亚硝基自由基、DPPH自由基、ABTS自由基体系对阿育魏实总黄酮抗氧化的能力进行研究。 [结果]在质量浓度0.025～0.500 mg/ml的范围内，阿育魏实总黄酮对羟自由基、超氧阴离子自由基、亚硝基自由基、DPPH自由基、ABTS自由基的清除率分别为31.68%～99.01%、27.45%～90.52%、11.62%～86.40%、41.31%～92.21%和17.53%～62.67%，且存在明显的量效关系。IC50分别为 0.038 49、0.053 51、0.271 60、0.026 17和0.033 87 mg/ml。[结论]阿育魏实总黄酮具有很好的体外抗氧化活性，是一种新型天然抗氧化物质来源。

阿育魏实；总黄酮；自由基；抗氧化活性

阿育魏实为伞形科糙果芹属[Trachyspermumammi(L.)Sparμge]植物的干燥成熟果实。全世界糙果芹属植物有12种，分布于非洲至南亚，我国有2种即糙果芹和马尔康糙果芹(T.triadiatumWoLff)及1个变种[T.scaberuLum(Franch.)WoLff.ex hand-Mazz.var.ambrosii- foLium(Franch)]又称阿米糙果芹[1]。新疆和田、喀什地区普遍栽培[2]，具有驱风散寒，健胃消食，用于食欲不振、胃寒作痛、小便不利、尿路结石、偏瘫及皮肤病等。阿育魏实所含麝香草酚，对口腔、咽喉粘膜有杀细菌和真菌的作用，对龋齿有防腐和局麻作用[3]，还用于皮肤化脓性感染及真菌和放线菌病，其醇提物(10%)对葡萄球菌、大肠杆菌有抑制作用，其稀释液可作祛痰剂[4]。阿育魏实用于很多维吾尔药的复方制剂中，是常用的药材品种，收载于中华人民共和国药品标准维吾尔药分册[5]。在印度等地阿育魏实被用作香料，也作为糕点和饮料添加剂和防腐剂[6]。

为了进一步开发利用阿育魏实资源，笔者以阿育魏实总黄酮为研究对象，采用羟自由基、超氧阴离子自由基、亚硝基自由基、DPPH自由基、ABTS自由基体系对阿育魏实总黄酮抗氧化的能力进行研究，以期为阿育魏实总黄酮的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象。阿育魏实种子，购自自治区维吾尔医院、喀什地区维吾尔医院、和田地区维吾尔医院，经新疆医科大学药学院天然药物化学教研室帕丽达·阿布利孜教授鉴定为伞形科糙果芹属[Trachyspermumammi(L.)Sparμge]的成熟果实。

1.1.2 主要仪器。UV-2550型分光光度计，购自日本岛津公司；SK2510HP超声波清洗仪，购自上海科导超声清洗仪有限公司；XS105型十万分之一电子天平，购自瑞士梅特勒-托利多公司。

1.1.3 主要试剂。芦丁对照品，购自中国药品生物制品检定所；OH试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；二苯代苦味肼基自由基，购自DPPH.sigma公司；ABTS，购自sigma公司；三羟甲基氨基甲烷(Tris)、亚硝酸钠、对氨基苯磺酸和盐酸萘乙二胺，均购自上海缘聚生物科技有限公司；浓盐酸、无水乙醇、三氯化铝均为分析纯，市售；水为超纯水，实验室自制。

1.2 方法

1.2.1 阿育魏实黄酮工作液的制备。精密称取阿育魏实样品：自治区维吾尔医院1.000 6 g，喀什地区维吾尔医院1.000 4 g，田地区维吾尔医院1.000 2 g，分别置于索氏提取器中，用石油醚加热回流30 min，弃去提取液，挥干残渣，然后加入浓度60%乙醇50 ml超声2次，每次30 min，过滤，用浓度60%的乙醇定容至100 ml，摇匀备用。

1.2.2 芦丁标准曲线的绘制[7]。精密称取120 ℃干燥恒重的芦丁对照品10.00 mg，用浓度60%的乙醇溶解，定容为100 ml，即配置成浓度为100 μg/ml标准溶液。准确吸取芦丁标准溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0和2.4 ml分别置于10 ml容量瓶中，加入浓度5%的三氯化铝溶液3 ml，pH=6的醋酸-醋酸钠缓冲液1 ml，最后用浓度60%的乙醇定容，摇匀，即配成标准工作溶液。荧光测定条件优化为：激发波长429.0 nm，发射波长529.0 nm，激发光谱通带10.0 nm，发射光谱通带5.0 nm，测定溶液的pH=6的条件下绘制芦丁标准曲线。

1.2.3 阿育魏实总黄酮含量测定。精密量取样品溶液0.5 ml至10 ml容量瓶中，加入浓度5%的三氯化铝3 ml，pH=6的醋酸-醋酸钠缓冲液1 ml，最后用浓度60%的乙醇定容至10 ml 。按“1.2.2”项下条件操作。

1.2.5 对·OH的清除能力[8-9]。参照Fenton反应法建立·OH自由基体系模型：H2O2与Fe2+混合后产生·OH的Fenton反应为:H2O2+Fe2+=OH-+·OH + Fe3+，试验操作按照南京建成生物工程研究所提供的·OH试剂盒说明书进行。在反应体系中分别加入样品溶液0.2 ml，检测体系中的·OH的剩余量。按下式计算阿育魏实总黄酮对·OH的清除率：·OH清除率(%)=(对照管OD-测定管OD)/ 对照管OD×100。

1.2.7 对DPPH自由基的清除能力[11]。DPPH自由基是一种稳定的有机自由基，由于DPPH自由基有一个单电子并在517 nm处有强的吸收，其乙醇溶液呈深紫色，如果有其他物质提供一个电子使此单电子配对，其吸收将会消失，褪色程度与其接受的电子呈定量关系。测定步骤为：取2 ml的样品溶液于5 ml容量瓶中，加入2 ml浓度为2×10-4mol/L的DPPH溶液混合均匀，密闭静止30 min后，在517 nm处测定其吸光度Ai，2 ml的0.1 mg/ml样品与2 ml醇溶液测定吸光度为Aj，2 ml DPPH溶液与2 ml 2次蒸馏水的吸光度Ao。按下式计算阿育魏实总黄酮对DPPH自由基的清除率。DPPH自由基清除率(%)=[Ao-(Ai-Aj)]/Ao×100。式中：Ao为未加抗氧化剂时DPPH溶液的吸光度；Ai为加抗氧化剂后DPPH溶液的吸光度；Aj为抗氧化剂在测定波长的吸光度。

1.2.8 ABTS自由基的清除能力[11]。取7 mol/L的ABTS和140 mmol/L的过硫酸钾溶液分别取5 ml和88 μl，在室温避光条件下静置过夜，配置ABTS自由基储备液，然后按照1∶50的比例用蒸馏水稀释成工作液。样品管中加入200 μl的样品溶液和3 ml的ABTS工作液，空白管用2次蒸馏水代替样品溶液，对照管用2次蒸馏水代替ABTS溶液，在室温条件下避光放置1 h，于730 nm处测定吸光度。按下式计算阿育魏实总黄酮对ABTS自由基的清除率。ABTS自由基清除率(%)=[Ao-(Ai-Aj)]/Ao×100。

2 结果与分析

2.1 阿育魏实总黄酮含量的测定 计算得芦丁回归方程问：Y=19.156X-0.090 5，R=0.999 8。试验结果表明，在4～24 μg/ml范围内，芦丁浓度与吸光度具有良好的线性关系。按回归方程计算阿育魏实总黄酮含量，和田地区总黄酮含量最高，为(14.06±0.26)mg/g；其次为喀什地区，含量为(13.72±0.21)mg/g；最小的为自治区维医院 ，含量为(13.24±0.23)mg/g(表 1)。

表1 阿育魏实总黄酮含量测定结果

2.2 阿育魏实不同浓度总黄酮清除各自由基的能力 图 1表明，阿育魏实总黄酮对羟基自由基、超氧阴离子自由基、亚硝基自由基、DPPH自由基、ABTS自由基都有一定的清除作用，在质量浓度0.025～0.5 mg/ml的范围内，其清除各自由基的能力分别为31.68%～99.01%、27.45%～90.52%、11.62%～86.40%、41.31%～92.21%和17.53%～62.67%，且随着浓度的增加，其对上述各自由基的清除能力增强，即两者之间存在量效关系。阿育魏实总黄酮浓度对各自由基清除率的变化曲线，对羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基以质量浓度的对数对清除率进行线性回归，计算IC50分别为0.038 49、0.053 51和0.271 60 mg/ml，对亚硝基自由基、ABTS自由基以质量浓度对清除率进行线性回归，计算IC50分别为0.026 17和0.033 87 mg/ml。结果发现，阿育魏实总黄酮对各自由基的清除能力有差别，IC50越低，清除自由基的能力越强，阿育魏实总黄酮对上述自由基的清除能力为：清除DPPH·能力最强，高于ABTS·，羟基自由基，超氧阴离子自由基，对亚硝基自由基的清除能力最低。所以可以选择性使用阿育魏实总黄酮清除不同的自由基。

2.3 不同地区阿育魏实总黄酮清除自由基能力的比较 取

图1 阿育魏实不同浓度总黄酮清除各自由基的能力

不同地区的阿育魏实总黄酮样品，配制相同浓度的维生素C溶液作阳性对照，计算清除率。图 2表明，不同地区阿育魏实总黄酮清除各自由基的能力有差别，其能力的差别与不同地区阿育魏实所含的总黄酮含量成正比，3个地区阿育魏实总黄酮含量为：和田地区14.06 mg/g，喀什地区13.72 mg/g，自治区维医院13.24 mg/g。与维生素C相比，除羟基自由基外，维生素C对各自由基的清除能力在0.1 mg/ml时，多高于阿育魏实总黄酮。

图2 不同地区阿育魏实总黄酮清除自由基的能力

3 结论与讨论

经过阿育魏实总黄酮对羟基自由基、超氧阴离子自由基、亚硝基自由基、DPPH自由基、ABTS自由基的清除作用试验表明，阿育魏实总黄酮能有效清除羟基自由基、超氧阴离子自由基、亚硝基自由基、DPPH自由基和ABTS自由基，其中清除DPPH自由基活性最强，且对各自由基的清除能力与用量成正相关。试验结果表明,阿育魏实总黄酮含量丰富。其总黄酮的抗氧化活性的研究显示，阿育魏实总黄酮具有较强的抗氧化活性，提示阿育魏实总黄酮极有可能是一种天然抗氧化剂的新资源，值得进一步深入研究。

[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志.第五十五卷，第二分册[M].北京:科学出版社，1997:13-15.

[2] 新疆生物土壤沙漠研究所.新疆药用植物志[M].乌鲁木齐:新疆人民出版社，1981:102.

[3] 刘勇民，沙吾提·伊克木.维吾尔药志.上册[M].乌鲁木齐:新疆人民出版社，1986:211-214.

[4] 江苏新医学院.中药大辞典.上册[K].上海:上海人民出版社，1977:1189.

[5] 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准维吾尔药分册[M].乌鲁木齐:新疆科技卫生出版社，1999：42.

[6] 马庆东，李国玉，王金辉.维吾尔药阿育魏实药理活性研究进展[J].农垦医学，2011，33(2)：180-184.

[7] 张敏，邱朝晖，曹庸，等.荧光光度法测定银杏叶总黄酮含量的研究[J].时珍国医国药，2005,16(3):238-239.

[8] 李思斯，江波，张涛，等.银杏外种皮总黄酮的提取及其抗氧化活性研究[J]．食品工业科技，2011,32(8)：291-294.

[9] 丁玉松，马龙.不同干燥方法对葡萄籽提取物抗氧化活性影响的实验研究[J]．新疆医科大学学报，2007,30(6)：578-580.

[10] 李超，王孟楚.鼠曲草总黄酮的抗氧化活性研究[J]．中国食品添加剂，2012(1)：111-115.

[11] 邱金东，汤昆． DPPH 和 ABTS 法测定核桃仁的体外抗氧化活性[J]． 中成药，2008，30(8):1215-1216．

Study on Antioxidant Activity of Total Flavonoids ofTrachyspermumammi(L.) Sparuge

ZHANG Hui, RENA·Kasim et al

(Pharmacy College of Xinjiang Medical University, Urumqi, Xinjiang 830011)

[Objective] To evaluate antioxidant capacity of total flavonoids ofTrachyspermumammi(L.) Sparuge. [Methods] Using hydroxyl free radicals, superoxide anion free radicals, nitroso free radicals, DPPH free radicals, and ABTS free radical system on total flavonoids ofTrachyspermumammi(L.) Sparuge. [Results] In the mass concentration within the range of 0.025-0.5 mg/ml, its ability to remove the free radicals was 31.68%-99.01%, 27.45%-90.52%, 11.62%-86.40%, 41.31%-92.21%, and 17.53%-62.67%, and there was significant dose-response relationship.IC50was 0.038 49 mg/ml, 0.03849 mg/ml, 0.03849 mg/ml, 0.053 51 mg/ml, and 0.033 87 mg/ml respectively. [Conclusion] Total flavonoids ofTrachyspermumammi(L.) Sparuge has high antioxidant activity in vitro and is a new kind of natural antioxidant.

Trachyspermumammi(L.) Sparuge; Total flavonoids; Free radical; Antioxidant activity

新疆医科大学创新基金(XJC2011117)。

张慧(1964-)，女，安徽亳州人，副教授，从事天然药物研究。*通讯作者，教授，博士生导师，博士，从事天然药物研究。

2014-05-04

S 567

A

0517-6611(2014)15-04624-02