p14ARF、mdm2、p53基因蛋白表达与胃癌相关性 及联合诊断价值分析

邓学田，齐文秀，锅红芬

论著·基础

p14ARF、mdm2、p53基因蛋白表达与胃癌相关性 及联合诊断价值分析

邓学田，齐文秀，锅红芬

目的分析p14ARF、mdm2、p53基因异常表达与胃癌相关性以及联合评定价值。方法基于S-P法(免疫组织化学染色法)检测18例正常胃黏膜组织(健康对照组)、24例胃黏膜增生组织(增生组)、50例胃黏膜癌变组织(癌变组)标本中p14ARF、mdm2、p53基因表达水平，分析其与胃癌的相关性及用于诊断胃癌的准确度、敏感度、特异度。结果癌变组、增生组、健康对照组p14ARF(88.0%、75.0%、22.2%)、mdm2(88.0%、70.8%、27.8%)、p53表达(48.0%、41.7%、11.1%)阳性率均呈下降趋势(P均<0.05)；三者表达与淋巴结转移呈正相关(P<0.05)；p14ARF、mdm2、p53联合用于胃癌诊断的准确度为93.4%，敏感度为96.0%，特异度为95.2%，均显著高于三者单独诊断的性能。结论p14ARF、mdm2、p53基因异常表达与胃癌发病和病情发展密切关联，联合检测三者的表达水平对胃癌的诊断及病情评定具较高临床价值。

p14ARF;mdm2;p53;胃癌;诊断价值

胃癌是高发性恶性肿瘤疾病之一，早期发病无明显症状，容易造成漏诊而耽误最佳治疗时机，晚期胃癌患者经常规术后5年内的存活率较低，其中完全切除术为31.3%，姑息切除术为11.7%。因此，寻找诊断胃癌的特异敏感性指标，成为有效治疗胃癌的关键。以往研究认为[1]，组织癌变是由多种因素共同作用的结果，其中控癌基因的变异、缺失、扩增起着非常关键的作用。而对基因异常因素导致胃癌的研究较少，本研究就p14ARF、mdm2、p53基因异常表达与胃癌相关性及联合诊断价值进行了分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2013年1—12月我院外科收治的胃癌患者50例，经病理检查确诊，取其病理标本为癌变组，其中男27例，女23例，年龄32～68(48.6±11.4)岁；组织学分类：黏液腺癌6例，其他腺癌44例；TNM分期：I、II期32例，III、IV期18例；分化程度：低度分化27例，中度分化16例，高度分化7例；有无淋巴转移：有淋巴转移33例，无淋巴转移17例。另选取本院病理科保存的24例胃黏膜非典型增生组织标本为增生组，男16例，女8例，年龄34～70(45.7±12.1)岁；选取于我院体检的18例健康人正常胃黏膜组织作为健康对照组，男10例，女8例，年龄33～71(46.3±13.2)岁。3组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 主要试剂 S-P试剂盒[2]、DAB显色试剂盒、兔抗人p14ARFmAb (单克隆抗体)、鼠抗人mdm2 mAb，鼠抗人p53 mAb等均购自北京西雅金桥生物技术有限公司，p14ARF、mdm2、p53三种基因蛋白阴性和阳性标本对照购自天津百浩生物科技有限公司。

1.3 检测方法 将研究室已有的石蜡包埋切片(厚度为4 μm[3])，基于免疫组织化学染色原理测定p14ARF、mdm2、p53三种基因蛋白表达水平[4]。取切片，常规使用二甲苯、乙醇、PBS冲洗液进行切片脱蜡；切片放入柠檬盐加热，于90℃环境维持15 min后室温冷却修复抗原；PBS洗脱后，H2O2下孵化再洗脱；去PBS，加一抗，放置低温(4℃)过夜；PBS洗脱，去洗液，加试剂A(聚合物增加剂)，放置体温环境20 min,洗脱；去洗液，加试剂B(酶标鼠/兔抗聚合物)，放置体温环境30 min,洗脱；去洗液，加新配制DAB，高倍镜下观察；自来水清洗，苏木素染色，酒精分化；滴加不同浓度酒精，二甲苯，封片，制成标本。观察时，各自取3种蛋白的阴性和阳性标本做检测结果对照[5]。

1.4 评定方法 按照染色程度得分和染色面积得分的乘积进行评定。主要存在于细胞浆或细胞核中的p14ARF、mdm2、p53三种蛋白的染色均按照文献[6]评定：不显色记为0分，浅黄色记为1分，棕黄色记为2分，棕褐色为3分；按所取肿瘤组织被染色面积计分[7]：<25%为1分，25%～40%为2分，41%～80%为3分，>80%为4分。最终结果以染色程度与染色面积各自得分的乘积评定。0分以“-”表示为阴性，1～2分以“+”表示弱阳性，3～4分以“++”表示阳性，>4分以“+++”表示强阳性。

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计数资料以%表示，采用χ2检验，按临床诊断试验统计方法，分析各种基因蛋白表达诊断的准确度、敏感度和特异度。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组p14ARF、mdm2、p53基因蛋白表达比较 3组间p14ARF、mdm2、p53基因蛋白表达见表1，图1见封3。

2.1.1 p14ARF蛋白表达水平比较： 健康对照组p14ARF阳性率为22.2%，增生组为75.0%，癌变组为88.0%，增生组显著高于健康对照组，癌变组明显高于增生组和健康对照组(P均<0.05)。由此可见p14ARF表达水平与胃癌发病相关。

2.1.2 mdm2蛋白表达水平比较： 健康对照组mdm2阳性率为27.8%，增生组为70.8%，癌变组为88.0%，增生组显著高于健康对照组，癌变组明显高于增生组和健康对照组(P均<0.05)。由此可见，mdm2表达水平与胃癌发病相关。

2.1.3 p53蛋白表达水平比较： 健康对照组p53阳性率为11.1%，增生组为41.7%，癌变组为48%，增生组显著高于健康对照组，癌变组明显高于健康对照组、增生组(P均<0.05)。由此可见， p53表达水平与胃癌发病相关。

2.2 癌变组各分型间p14ARF、mdm2、p53阳性表达比较 p14ARF、mdm2、p53阳性表达率与胃癌TNM分期、分化程度无显著关系(P>0.05)；而有淋巴结转移病例中p14ARF、mdm2、p53阳性表达率较无淋巴结转移者显著增高(P<0.05)，表明三者水平可用于检测胃癌是否发生转移，见表2。

表1 3组间p14ARF、mdm2、p53基因表达蛋白的水平比较 (例)

注：与健康对照组比较，*P<0.05；与增生组比较，#P<0.05

表2 癌变组各分型间p14ARF、mdm2、p53阳性表达率的比较 [例(%)]

2.3 p14ARF、mdm2、p53三者单独及联合用于胃癌诊断的性能比较 p14ARF、mdm2、p53联合用于胃癌诊断的准确度为93.5%，敏感度为96.0%，特异度为95.2%，均显著高于三者单独诊断的性能。见表3。

表3 p14ARF、mdm2、p53三者单独及联合用于胃癌诊断的性能比较 (%)

注：与p14ARF、mdm2、p53三者单独诊断比较，*P均<0.05

3 讨 论

胃癌作为一类发病率较高的恶性肿瘤疾病，严重危害着人们的身体健康。当前，医学对胃癌的发病机制尚不清晰，但大量研究证实[8]：组织癌变与基因的表达异常有着不可分割的联系。基因是通过表达成蛋白质来介导调控细胞的生长、增殖、分裂周期、凋亡。当相关基因发生突变、缺失、增长等变异时，调控蛋白水平也会表达异常，使细胞的生长、增殖、凋亡、分裂周期等失去控制发生紊乱，从而导致局部组织的癌变[9，10]。在相关癌变调控基因中大致包括两类[11]，一类为癌变激活基因，一类为癌变抑制基因。而两类基因主要由通路来完成对细胞凋亡生长周期的调控。当前关于人类恶性肿瘤细胞调控的通路主要有2种，即p53通路和Rb通路，其中前者为p14ARF、mdm2、p53三种基因共同通路，后者为p16INK4a、cyclinD、Rb三种基因共同通路。有研究证实p14ARF、mdm2、p53基因表达异常与子宫内膜癌变、前列腺癌、肺癌、肝癌等均具一定相关性。

p14ARF、mdm2、p53三种基因主要通过相互作用来调控细胞癌变。p53能够介导细胞的生长、凋亡等，具抑制细胞癌变的作用，原发性p53为一类抑制恶性肿瘤基因，半衰期较短，使用免疫组化法无法测定含量，但当原发性p53发生变异时，突变的p53不仅失去癌症抑制作用，而且促进细胞生长，发生无限制增殖，引发癌变。同时突变的p53半衰期较长，能够得到较多的累积，使本次研究的免疫组化测量法得以实现。而mdm2对细胞癌变的调控主要通过结合p53减弱其活性或诱导凋亡，阻止p53的调控作用来间接实现。mdm2主要通过3种方式与p53结合发挥作用：(1)抑制p53转录表达的活性；(2)阻止p53由核膜向胞浆转移，使p53直接在胞浆中被相关酶体降解；(3)直接作用于p53，使其泛素化而降解。p14ARF是一类抑制癌变基因，通过介导mdm2对p53的作用来间接实现对癌变细胞的抑制。p14ARF主要通过3种方式来实现作用：(1)阻止mdm2的转移，将其固定在核仁，解除mdm2对p53的活性抑制作用；(2)与mdm2、p53的表达物同时结合形成联合体，阻止二者的生成，抑制癌变；(3)结合mdm2后降低其对p53的降解作用。而在本研究中发现，p14ARF、mdm2、p53表达水平在癌变组、增生组、健康对照组呈下降趋势(P均<0.05)，三者表达与淋巴结转移呈正相关(P<0.05)，由此可见，三者的表达与胃癌发病有关；p14ARF、mdm2、p53联合用于胃癌诊断的准确度为93.5%，敏感度为96.0%，特异度为95.2%，均显著高于三者单独诊断的性能，由此可见，三者联合检测用于胃癌的诊断有显著临床价值。

1 Park J, Scherer R. Adipocyte-derived endotrophin promotes malignant tumor progression[J]. Journal of Clinical Investigation，2012，122(11)：4243.

2 Calon A, Espinet E, Palomo-Ponce S, et al. Dependency of colorectal cancer on a TGF-β-driven program in stromal cells for metastasis initiation [J]. Cancer Cell, 2012，22(5)：571-584.

3 Ueno H, Mochizuki H, Shirouzu K, et al. Multicenter study for optimal categorization of extramural tumor :deposits for colorectal cancer staging[J]. Annals of Surgery,2012,255(4):739.

4 Halford MM,Tebbutt NC,Desai J,et al.Towards the biomarker-guided rational use of antiangiogenic agents in the treatment of metastatic colorectal cancer[J].Colorectal Cancer,2012,1(2):149-161.

5 Allen WL,Stevenson L, Coyle VM,et al.A systems biology approach identifies SART1 as a noveldeterminant of both 5-fluorouracil and SN38 drug resistance in colorectal cance[J].Molecular Cancer Therapeutics,2012,11(1)：119-131.

6 陈军，吴飞翔，覃思繁，等. 肝细胞癌组织STAT3和p14ARF蛋白的表达和相关性研究[J].实用肿瘤杂志，2013,28(1)：24-27.

7 宋红春，陆为民.大肠癌与p53、mdm-2、bcl-2及bax相关性的研究现状[J].实用中西医结合临床，2013，13(8):92-94.

8 梁迎春,程龙,叶棋浓.肿瘤基因治疗的研究进展[J].生物技术通讯,2012,23(3)：436-439.

9 Robbins AS,Siegel RL,Jemal A.Racial disparities in stage-specific colorectal cancer mortality rates from 1985 to 2008 [J].Journal of Clinical Oncology,2012,30(4):401-405.

10 龙海华，梁秀兰，胡宏波,等.PTPN11基因及幽门螺杆菌与广西柳州地区胃癌易感性关系的研究[J].疑难病杂志，2013，12(6)：436.

11 Fujioka N, Bitterman PB. Molecular targeted therapy in lung cancer [J]. Minnesota Medicine,2012,95(10)：38.

Analysisoftherelationshipbetweengastriccancerandtheabnormalexpressionofp14ARF,mdm2,p53gene

DENGXuetian,QIWenxiu,GUOHongfen.

DepartmentofPathology,BaodingSecondCentralHospital，Baoding072750,China

ObjectiveTo analyse the relationship between gastric cancer and the abnormal expression of p14ARF,mdm2,p53 gene, as while the correlation value and a joint assessment.MethodsBased on the S-P method (immunohistochemistry), 18 cases of normal gastric mucosa (control group), 24 cases of gastric mucosa hyperplasia (hyperplasia group), 50 cases of gastric cancer tissues (carcinoma group) were detected with the expression level of p14ARF,mdm2,p53 genetic samples, analyze its relationship with gastric carcinoma and for accuracy, sensitivity, specificity of diagnosis of gastric cancer.ResultsCarcinoma group, hyperplasia group, healthy control group's p14ARF(88.0%, 75.0%, 22.2%),mdm2 (88.0%, 70.8%, 27.8%),p53 expression (48.0%, 41.7%, 11.1%), the positive rate showed a downward trend (P<0.05); three expression was positively correlated with lymph node metastasis (P<0.05); p14ARF,mdm2,p53 joint for gastric cancer diagnosis accuracy was 93.4%, sensitivity was 96%, specificity was 95.2%, the performance was significantly higher than that of the three separate diagnosis.ConclusionAbnormal expression of p14ARF,mdm2,p53 genes associated with the onset and disease progression of gastric carcinoma, the expression level of the three combined detection in diagnosis and condition evaluation of gastric cancer with high clinical value.

p14ARF;mdm2;p53;Gastric cancer; Diagnostic value

072750 保定市第二中心医院病理科

10.3969/j.issn.1671-6450.2014.06.024

2014-03-04)