大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞的培养及鉴定*

孟 宇，吕 俊，齐世美，陈靠山

(皖南医学院生物化学研究室，安徽芜湖241002)

勃起功能障碍(Erectile Dysfunction，ED)是常见的男性疾病，给患者的生活造成不良影响.有学者通过体内外实验已经证实NO在舒张海绵体平滑肌方面起着重要的作用［1-3］.正常阴茎海绵体中，平滑肌占40%～52%，海绵体平滑肌数量减少，结缔组织增加可导致勃起功能障碍.阴茎勃起过程中海绵体平滑肌发挥着重要的作用［4-6］.在性刺激下，神经信号通过阴茎海绵体神经传导至阴茎末梢，释放诱发阴茎勃起的生物活性因子，使阴茎动脉扩张和阴茎海绵体平滑肌松弛，阴茎勃起.近年来，对ED的发生机制研究已深入分子水平，而其所需的材料主要是阴茎海绵体平滑肌细胞.因此，本实验研究了大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞培养的可行性，以期为今后探讨ED病治疗机制奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料

(1)实验动物.SD大鼠20只，雄性，6～7周龄，性成熟，体重(180±10)g，南京青龙山动物养殖厂.

(2)主要试剂.DMEM(high glucose)，GIBCO 公司；Ⅱ型胶原酶，南京凯基生物；抗生素，南京凯基生物；α-SMA antibody，武汉博士德生物技术有限公司.

(3)仪器.超净工作台，苏州净化设备有限公司，型号为SW-CJ-1FD；CO2培养箱，型号XD-101；倒置显微镜，OLYMPUS公司，型号CKX4.

1.2 方法

(1)分离细胞.处死SD大鼠，取出阴茎组织，PBS液冲洗；在超净工作台中将组织剪碎成1～2mm的组织小块，放于六孔板中，用0.2%Ⅱ型胶原酶消化2h，加入等体积0.25%Trypsin继续消化0.5h，在显微镜下观察，当基本出现单个细胞时，用完全培养液及时终止消化［7］，离心方法去除消化液后，将沉淀用培养液混悬，置于培养瓶中，于5%CO2培养箱培养；24h将未贴壁的细胞转入新培养瓶，即为P2，贴壁部分细胞为P1，以后每隔24h，将未贴壁的细胞转入新培养瓶，依次得到P3、P4、P5.

(2)细胞传代.细胞用完全培养液重悬，分瓶培养.

(3)平滑肌细胞的鉴定(免疫细胞化学法)［8］.制备细胞爬片，将爬有细胞的盖玻片用PBS洗两遍，然后加入4%的多聚甲醛固定3h.严格按照免疫组化方法步骤水化，通透，洗涤，灭活酶，洗涤，加一抗，洗涤，加强增剂，洗涤，加酶加二抗，DAB法显色，封片等，然后在显微镜下进行观察.

2 结果

2.1 细胞形态

细胞经过第3～4d培养，有梭形细胞从边缘长出，经4～5次传代后，生长缓慢.由图版I可知，α-SMA在P1～P5中的表达量依次降低，大鼠阴茎海绵体经消化酶消化后，随着贴壁时间的增加，细胞表达α-SMA逐渐减少.

2.2 免疫组化鉴定结果

显微镜下有梭形平滑肌细胞，胞质浅黄，可见黄色的肌动蛋白表达.α-平滑肌肌动蛋白在P1～P5中的表达量依次降低，大鼠阴茎海绵体经消化酶消化后，随着贴壁时间的增加，细胞表达α-SMA逐渐减少；可判定大鼠阴茎海绵体经消化酶消化后，24h内贴壁的细胞(P1)是大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞(图版I).

图版I α-SMA在P1～P5中的表达

3 讨论

根据文献［9］和阴茎组织的结构，平滑肌细胞可以用组织块培养方法进行培养.组织块培养法容易掌握，但所需时间较其他方法长.所以，采用酶消化组织块法消化分离平滑肌细胞，加速了细胞迁出时间，细胞贴壁迅速，缩短了培养时间.由于细胞贴壁培养时有成纤维细胞等其他细胞混杂，所以采用了差速贴壁法纯化细胞，且由于成纤维细胞和CCSM形态具有相似性，故需进行CCSM的鉴定，我们用免疫组化方法鉴定，平滑肌细胞内有肌动蛋白表达，随着传代次数的增加和贴壁时间的延长，平滑肌特异性蛋白α-SMA在P1～P5中的表达量依次降低，证实其确采用差速贴壁后细胞纯度明显提高.实验用性成熟的SD雄性大鼠进行取材，解剖部位清晰，取材方便，但取材要保证无菌操作.因此，本实验采用胶原酶消化和差速贴壁法进行平滑肌细胞的原代培养，方法方便，切实可行，能获得功能和结构完整的细胞，为相关研究提供良好的实验材料.

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