华重楼愈伤组织培养及薯蓣皂苷含量测定

王跃华+陈燕+张珏+张红玉+游亚莉+田孟良+

摘要：以华重楼［Ｐａｒｉｓ ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ Ｓｍｉｔｈ ｖａｒ． ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ （Ｆｒａｎｃｈ．）Ｈａｒａ］植物多种器官为外植体，经不同消毒处理和培养基诱导培养后，观察其愈伤组织的诱导生长情况；并以ＴTＣ法检测诱导产生的愈伤组织中的薯蓣皂苷含量。结果表明，华重楼的隐芽、内层芽鞘、根茎、预处理后根茎和子房外植体经诱导培养后，均可不同程度地产生愈伤组织；其中以预处理后根茎外植体产生的愈伤组织生长速度最快，诱导率也最高，为３３．５％。经检测结果显示，多次继代培养的华重楼愈伤组织中含有与华重楼对照药材和薯蓣皂苷对照品相同的薯蓣皂苷或其类似物。

关键词：华重楼［Ｐａｒｉｓ ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ Ｓｍｉｔｈ ｖａｒ． ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ （Ｆｒａｎｃｈ．）Ｈａｒａ］；外植体；诱导；愈伤组织

中图分类号：Ｑ８１５文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０14）08－1936-05

Ｃａｌｌｕｓ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ of Ｓｔｅｒｏｉｄａｌ Ｓａｐｏｎｉｎ Ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｐａｒｉｓ ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ Ｓｍｉｔｈ vａｒ． Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ （Franch.） Hara

ＷＡＮＧ Ｙｕｅ－ｈｕａ１， ＣＨＥＮ Ｙａｎ２， ＺＨＡＮＧ Ｊｕｅ１， ＺＨＡＮＧ Ｈｏｎｇ－ｙｕ１， ＹＯＵ Ｙａ－ｌｉ１， ＴＩＡＮ Ｍｅｎｇ-ｌｉａｎｇ３

（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｃｈｅｎｇｄｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１０１0６， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｓｉｃｈｕａｎ Ｊｉｎｔｕｄｉ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈｅｒｂａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ｇｒｏｕｐ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１１１３０，Ｃｈｉｎａ；

３．Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｒｕｒａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｉｃｈｕａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ＹａＡｎ ６２５０１４， Ｓｉｃｈｕａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Tｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｏｒｇａｎs ｏｆ Ｐａｒｉｓ ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ Ｓｍｉｔｈ ｖａｒ． ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ（Ｆｒａｎｃｈ．）Ｈａｒａ were used as ｅｘｐｌａｎｔｓ and were ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｅｄ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｗａｙ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ ｓｅｒｉｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ. Tｈｅ ｄｉｏｓｃｉｎ ｏｆ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒａｌ ｃａｌｌｕｓ was detected by TTC． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｏｆ ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｔｅｓ， ｉｎｎｅｒ ｃｏｌｅｏｐｔｉｌｅ， ｒｈｉｚｏｍｅ， ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ｒｈｉｚｏｍｅ ａｎｄ ｏｖａｒｙ could ｐｒｏｄｕｃｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｎｄ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｉｎｇ. Aｍｏｎｇ ｔｈｅｍ ，ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｓｐｅｅｄ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ ｂｙ ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ｒｈｉｚｏｍｅ ｗａｓ ｆａｓｔ， ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｓｔ ｔｏ ３３．５％． Ｔｈｅ ｓｅｖｅｒａｌ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃａｌｌｕｓ ｓｈｏｗｅｄ that ｔｈｅ ｓａｍｅ ｄｉｏｓｃｉｎ ｏｒ ｉｔｓ ａｎａｌｏｇｕｅ ｗｉｔｈ ｒｈｉｚｏｍｅ ａｎｄ ｄｉｏｓｃｉｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ． Tｈｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｅｘｐｌａｎｔ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ was screened out. Cａｌｌｕｓ could ｂｅ ａｃｑｕｉｒｅｄ ａｆｔｅｒ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ. Tｈｅ ｓｅｖｅｒａｌ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｄ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｄｉｏｓｃｉｎ ｏｒ ｉｔｓ ａｎａｌｏｇｕｅ ｗｉｔｈ ｒｈｉｚｏｍｅ ａｆｔｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ. Iｔ will ｐｒｏｖｉｄｅ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｗａｙ ｆｏｒ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ ｂｙ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐａｒｉｓ ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ Ｓｍｉｔｈ ｖａｒ． ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ （Ｆｒａｎｃｈ．）Ｈａｒａ； ｅｘｐｌａｎｔｓ； ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ； ｃａｌｌｕｓ

重楼（Ｒｈｉｚｏｍａ ｐａｒｉｄｉｓ）是名贵中药材之一，全世界共有２４种，我国拥有１９种，其中以西南地区各省的种类和资源尤为丰富［１］。重楼为百合科植物华重楼（七叶一枝花）［Ｐａｒｉｓ ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ Ｓｍｉｔｈ ｖａｒ． ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ （Ｆｒａｎｃｈ．）Ｈａｒａ］和滇重楼［Ｐ． ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ Ｓｍｉｔｈ ｖａｒ． ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ（Ｆｒａｎｃｈ．） Ｈａｎｄ-Ｍａｚｚ］的干燥根茎［２］。重楼主要有效成分是甾体皂苷，其苷元主要为异螺甾烷醇类的薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元［３］。现代药理研究表明，重楼具有抗肿瘤、止血、止咳平喘、抗菌、抗病毒、避孕等作用，其良好的疗效使其已被众多的制药工业用于药剂的生产中，是云南白药、宫血宁、热毒清等重要中成药的主要成分，用途极广泛［４－８］。

随着中医药产业的快速发展，重楼药材的需求量正以每年２０％的幅度递增，而当前重楼主要靠采挖野生资源。由于长期过度采挖，致使野生重楼资源遭到了毁灭性的破坏，重楼已被列为国家重点保护野生药材濒危物种，也是云南省３０个重要濒危药用植物之一［９，１０］。利用组织培养技术生产药用植物具有生长周期短、繁殖率高等优点，还能降低灾害性气候对植物生长的不利影响。因此积极开展对重楼植物的组织培养研究是解决当前重楼药材严重短缺和更好地保护其野生植物资源的有效方法。然而到目前为止，重楼植物的组织培养研究都还未取得实质性进展［１１－１３］，也未获得含有重楼有效成分皂苷的愈伤组织。

本研究针对当前重楼植物在组织培养研究过程中存在的诸多问题，以华重楼的多种器官为外植体，开展了大量有针对性的研究工作，以期利用组织培养技术有效解决重楼植物快速无性繁育的瓶颈问题以及为生产重楼植物次生代谢产物提供参考。

１ 材料与方法

１．１材料

１．１．１样品重楼药材采自四川省都江堰市，经四川大学张浩教授鉴定为百合科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）重楼属（Ｐａｒｉｓ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）植物华重楼的根茎；薯蓣皂苷对照品（批号：１１１７０７－２００５０１），由中国药品生物制品鉴定所提供。

１．１．２药品与试剂甲醇（批号：２００７０８３０）、三氯甲烷（批号：２０１１０５２４）、硫酸均由成都科龙化工试剂厂提供（批号：２００８０７２１）；纯净水，蓝光饮用纯净水；其他试剂均为分析纯。

１．１．３仪器硅胶Ｇ板，由上海信谊仪器厂提供；紫外灯，由无锡科达仪器厂提供。

１．２方法

１．２．１华重楼各营养器官外植体消毒和愈伤组织诱导选取华重楼生长健康的隐芽，从隐芽上剥离的内层芽鞘、根、幼叶、地上茎、根茎和预处理后根茎（切取倒苗后重楼带芽的前两节根茎，移栽到土壤中待其有新根长出时，挖出移栽体，再切去前端的芽体和后面一节根茎，只保留靠近芽体部分的第一节根茎，即为预处理后根茎）等为外植体。在超净工作台上先将各外植体经７０％乙醇消毒３０ ｓ，再用０．１％升汞溶液消毒，其中隐芽、内层芽鞘和幼叶消毒６ ｍｉｎ，地上茎消毒８ ｍｉｎ，根、根茎及预处理后根茎消毒１２ ｍｉｎ，最后用无菌水冲洗５次，并用吸水纸吸干各外植体水分；将消毒完成的外植体切成适当大小后接种于 ＭＳ＋２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ ＋２．０ ｍｇ／Ｌ ＩＡＡ培养基中，在温度（２０±２） ℃，光照时间１２ ｈ／ｄ，光照度１ ０００～１ ５００ ｌｘ的培养条件下诱导培养６５ ｄ，统计各外植体愈伤组织诱导情况。

１．２．２华重楼花各组织外植体消毒和愈伤组织诱导选取华重楼植物花的花萼、花瓣、花药、花丝、子房和花亭为外植体，在超净工作台上先用０．１％升汞消毒处理，其中花萼、花亭和子房消毒８ ｍｉｎ，花瓣、花丝和花药消毒３ ｍｉｎ，再用无菌水冲洗３次，并用吸水纸吸干材料表面水分后将花萼、花瓣、花丝和花药直接接入培养基中，花亭和子房纵切成两半后再接入培养基中，培养基配方和培养条件与“１．２．１”相同。

１．２．３华重楼愈伤组织增殖选取经预处理后根茎外植体产生的白色和浅黄白色生长状况良好的愈伤组织接入增殖培养基中，分别取培养生长５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５和６０ ｄ的愈伤组织并称重，绘制愈伤组织的增殖生长曲线。

１．２．４细胞存活率检测试验培养材料的细胞存活率检测采用氯化三苯基四氨唑还原法，简称ＴＴＣ法［１４］。

１．２．５愈伤组织中薯蓣皂苷含量测定对照品溶液的制备：取薯蓣皂苷对照品（使用前于五氧化二磷干燥器中干燥１２ ｈ以上）适量，准确称取１ ｍｇ，加甲醇配制成１ ｍｇ／ｍＬ的对照品溶液。

华重楼对照药材溶液的制备：取华重楼药材于５５ ℃烘干后粉碎过４０目筛制得粉末。取粉末０．５ ｇ，加８５％乙醇１０ ｍＬ，加热回流３０ ｍｉｎ后滤过，滤液作为对照药材溶液。

供试品１的制备：选取继代培养５代的华重楼愈伤组织按对照药材溶液的制备方法进行制备。

供试品２的制备：选取继代培养２代的华重楼愈伤组织按对照药材溶液的制备方法进行制备。

空白对照品的制备：取８５％乙醇溶液作为空白对照品溶液。

１．２．６数据统计数据计算结果以x±ｓ表示，采用ＳＰＳＳ １９．０软件进行方差分析，新复极差法进行多重比较，其中Ｐ＜０．０５为差异显著，Ｐ＜０．０１为差异极显著。

２结果与分析

２．１华重楼各营养器官外植体愈伤组织诱导

本试验选取华重楼７个不同部位的营养器官经消毒处理后接入ＭＳ＋２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋２．０ ｍｇ／Ｌ ＩＡＡ培养基中，在培养６５ ｄ后统计其外植体愈伤组织诱导情况结果见表１。

从表１可以看出，华重楼植物的隐芽、内层芽鞘、未预处理根茎和预处理后根茎４个部位的外植体都能不同程度地诱导出愈伤组织，其中经预处理后根茎外植体愈伤组织诱导率极显著高于其他外植体，为（３３．５±１．６）％（Ｐ＜０．０１）。经预处理后根茎外植体在接入培养基后３０～４０ ｄ就出现明显的启动现象，根茎横切面的颜色由最初的白色变为浅棕黄色，并且其器官内的基本组织会产生明显地体积膨大，常将根茎的皮部组织胀破，最终使得基本组织向外膨出，随后在膨出的基本组织表面产生大量的白色愈伤组织，形如花菜状、质地较紧密（图１）；未预处理根茎在培养过程中，组织膨出不明显，其愈伤组织的诱导率也较低为（１９．６±１．３）％，产生的愈伤组织颜色为白色和黄色，其产生数量也较少（图２）；隐芽外植体在接入培养基的初期，主要表现为芽体的整体膨大，但随着培养时间的延长，有部分隐芽出现了抽苗现象，但始终未见有愈伤组织产生（图３）；而另一部分隐芽在体积膨大的基础上，逐渐愈伤化（图４），培养６５ ｄ后统计愈伤组织诱导率为（１２．８±１．３）％。内层芽鞘外植体在接入培养基２５ ｄ左右，芽鞘体积膨大而呈肥厚肉质，并在接下来的培养过程中，可观察到膨大芽鞘的内表面和边缘逐渐长出质地较紧密、颜色为白色的团块状愈伤组织（图５）。

而华重楼的幼叶、地上茎和根外植体在培养６５ ｄ后都未观察到有愈伤组织的产生；尽管幼叶和地上茎也能在培养基中保持较长时间的活力，而且幼叶膨大也非常明显（图６），但随着培养时间的延长，幼叶会逐渐枯萎死亡，而地上茎则会因褐化而死亡；根外植体在接入培养基后，一直未发生形态上的变化，并且染菌率也低，这与Cheung等［７］的研究结果相似，在培养８０ ｄ后用ＴＴＣ法检测培养的根细胞存活率仅为（４．５±０．２）％。

２．２华重楼花各器官外植体的愈伤组织诱导

华重楼花各器官外植体也接种在愈伤组织诱导培养基上，在培养６０ ｄ后统计各外植体的情况结果见表２。从表２可以看出，６种不同外植体在接入培养基中培养６０ ｄ后，只观察到子房外植体有少量愈伤组织的产生。子房产生愈伤组织的部位主要在子房切面的子房壁伤口处有少量颜色为黄色和黄褐色零星颗粒状愈伤组织产生（图７）；子房产生的愈伤组织生长时间很短也就停止了，其原因主要是因为子房壁伤口在培养过程中产生褐变较严重的缘故。

花萼和花丝外植体在接入培养基后大多会出现膨大，但随着培养时间的延长，最终都出现枯萎死亡；而花瓣和花药外植体在接入培养基后，形态不发生变化，在培养８０ ｄ后用ＴＴＣ法检测其细胞均已死亡；花亭外植体在接入培养基后，部分可在节处可产生一定的膨大，但随着培养时间的延长，外植体会产生褐变而死亡。

２．３华重楼愈伤组织的增殖

选经预处理后根茎外植体产生的白色和浅黄白色愈伤组织２ ｇ／Ｌ接入ＭＳ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋１．０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ的增殖培养基中，每隔５ ｄ取样称重并观察其生长情况，绘制出愈伤组织增殖生长曲线见图8。从图8可以看出，在华重楼愈伤组织的增殖生长过程中，延迟期时间较长为１５～２０ ｄ左右；此后愈伤组织生长进入对数生长期，并开始迅速增殖生长。对数生长期持续时间为２０～２５ ｄ 左右，在此时间段愈伤组织细胞可增殖２倍多；此后，愈伤组织增殖生长进入平稳期，其增殖速度也明显减慢。

２．４薯蓣皂苷含量的测定结果

按照《中华人民共和国药典》２０１０版薄层色谱法（附录ＶＩＢ）试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各５ μL以及对照品溶液１０ μL，分别点于同一硅胶Ｇ薄层板上，以三氯甲烷－甲醇－水（体积比１５∶５∶１）的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷１０％硫酸乙醇溶液在１０５ ℃加热至斑点显色清晰，分别至日光灯和紫外光灯（３６５ ｎｍ）下检视。

由图９、表３可以看出，供试品１（继代培养５代的华重楼愈伤组织）与对照药材和对照品都有颜色相同、迁移率相当的显色斑点， 表明继代培养５代的华重楼愈伤组织中具有薯蓣皂苷或其类似物；供试品２（继代培养２代华重楼愈伤组织）不含与对照品相同的斑点，但在Ｒｆ＝０．６１１处的斑点与对照药材和供试品１相当，表明继代培养２代华重楼愈伤组织不含有薯蓣皂苷，但含有华重楼的其他成分；试验结果显示空白对照品无干扰。

３小结与讨论

在对华重楼愈伤组织的诱导过程中，笔者发现在适宜的时期选择有效的外植体部位是非常重要的。本研究中所采用的两种根茎外植体都是除去了芽体后保留的第一节的根茎，结果表明，经预处理后的根茎外植体不仅愈伤组织诱导率更高，而且产生的愈伤组织数量也更多，愈伤组织的生长质量也更好，因而也确保了后继愈伤组织的成功增殖；本研究也曾采用了除第一节根茎以外的其他根茎作为外植体进行愈伤组织诱导，但最终都未获得愈伤组织，这也与延龄草（Trillium tschonoskii Maxim.）不同部位根茎诱导愈伤组织的情况相似［１５］；因此，华重楼植物顶芽后的第一节根茎细胞保持有较强的潜在分裂能力，细胞经诱导培养后较易脱分化产生愈伤组织。

薯蓣皂苷作为华重楼植物中的重要有效成分，是属于植物的次生代谢产物。经多次继代培养的华重楼愈伤组织，是可以在产生大量初生代谢产物的基础上，进一步产生薯蓣皂苷次生代谢物；因此，在重楼植物以后的组织培养研究过程中，可有效地通过改变培养基中各成分的种类、比例以及积极开展前体饲喂技术和利用发根农杆菌的遗传转化技术，最终实现利用生物技术生产重楼植物有效成分薯蓣皂苷的目的。

本研究研究了华重楼各部位外植体诱导产生愈伤组织的情况，筛选出了经预处理后的根茎是产生愈伤组织的最佳外植体，并成功地建立了华重楼愈伤组织增殖培养体系，为开展华重楼组培苗的生产和筛选出次生代谢产物含量高的细胞株进行扩大培养奠定了工作基础。

参考文献：

［１］ 李恒．重楼属植物［Ｍ］．北京：科学出版社，１９９８．１－７．

［２］ 国家药典委员会．中国药典一部［Ｚ］．北京：化学工业出版社，２０１０．２４３．

［３］ 张晓洁，查岭生，陈小静，等．一株产重楼皂苷内生细菌的分离与鉴定［Ｊ］．微生物学通报，２００６，３３（５）：８４－８８．

［４］ 张霄霖，刘月蝉． 重楼的研究与应用［Ｊ］．中国中医药科技，２０００，７（５）：３４６－３４７．

［５］ 汤海峰，赵越平，蒋永培．重楼属植物的研究概况［Ｊ］．中草药，１９９８，２９（１２），８３９－８４３．

［６］ 马云淑，桂镜生，朱燕，等．滇产重楼资源及市场情况调查［Ｊ］．云南中医学院学报，１９９７，２０（２）：２４－２６．

［７］ ＣＨＥＵＮＧ Ｊ Ｙ， ＯＮＧ Ｒ Ｃ， ＳＵＥＮ Ｙ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌｉｎ Ｄ ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｒ ｉｎ ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］． Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００５（２）：２０３－２１１．

［８］ ＷＡＮＧ ＧＸ， ＨＡＮ Ｊ， ＺＨＡＯ Ｌ Ｗ， ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｈｅｌｍｉｎｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｐａｄｓ ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ［Ｊ］． Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２０１０， １７（１４）： １１０２－１１０５．

［９］ 钟廷瑜，舒光明，易尚平．四川重楼属药用植物资源研究［Ｊ］．资源开发与市场，１９９８，１４（５）：２０２-205．

［１０］ 周浓，段宝忠，夏从龙，等．滇重楼不同生长发育期化学成分的变化规律［Ｊ］．中国实验方剂学杂志，２０１１，１７（５）：７０-73．

［１１］ 李群，陈丽萍， 葛方兰．重楼属植物愈伤组织的诱导和培养［Ｊ］．四川师范大学学报（自然科学版），２００６，２９（１）：１２０－１２２．

［１２］ 杨丽云，陈翠，吕丽芬，等．云南重楼的组织培养与植株再生［Ｊ］．植物生理学通讯，２００８，４４（５）：９４７－９４８．

［１３］ 唐炳兰．中药重楼的研究进展［Ｊ］．右江民族医学院学报，２００６（６）：１０６２－１０６４．

［１４］ 叶芳，夏胜，梅兴国．红豆杉愈伤组织超低温保存有关因素的研究［Ｊ］． 武汉植物学研究，２００１，１９（４）：３２７－３３１．

［１５］ 胡天印，钱丽华，刘汉卿．濒危植物延龄草愈伤组织诱导研究［Ｊ］．浙江师范大学学报（自然科学版），２００６，２９（３）：３２６－３２９．

３小结与讨论

在对华重楼愈伤组织的诱导过程中，笔者发现在适宜的时期选择有效的外植体部位是非常重要的。本研究中所采用的两种根茎外植体都是除去了芽体后保留的第一节的根茎，结果表明，经预处理后的根茎外植体不仅愈伤组织诱导率更高，而且产生的愈伤组织数量也更多，愈伤组织的生长质量也更好，因而也确保了后继愈伤组织的成功增殖；本研究也曾采用了除第一节根茎以外的其他根茎作为外植体进行愈伤组织诱导，但最终都未获得愈伤组织，这也与延龄草（Trillium tschonoskii Maxim.）不同部位根茎诱导愈伤组织的情况相似［１５］；因此，华重楼植物顶芽后的第一节根茎细胞保持有较强的潜在分裂能力，细胞经诱导培养后较易脱分化产生愈伤组织。

薯蓣皂苷作为华重楼植物中的重要有效成分，是属于植物的次生代谢产物。经多次继代培养的华重楼愈伤组织，是可以在产生大量初生代谢产物的基础上，进一步产生薯蓣皂苷次生代谢物；因此，在重楼植物以后的组织培养研究过程中，可有效地通过改变培养基中各成分的种类、比例以及积极开展前体饲喂技术和利用发根农杆菌的遗传转化技术，最终实现利用生物技术生产重楼植物有效成分薯蓣皂苷的目的。

本研究研究了华重楼各部位外植体诱导产生愈伤组织的情况，筛选出了经预处理后的根茎是产生愈伤组织的最佳外植体，并成功地建立了华重楼愈伤组织增殖培养体系，为开展华重楼组培苗的生产和筛选出次生代谢产物含量高的细胞株进行扩大培养奠定了工作基础。

参考文献：

［１］ 李恒．重楼属植物［Ｍ］．北京：科学出版社，１９９８．１－７．

［２］ 国家药典委员会．中国药典一部［Ｚ］．北京：化学工业出版社，２０１０．２４３．

［３］ 张晓洁，查岭生，陈小静，等．一株产重楼皂苷内生细菌的分离与鉴定［Ｊ］．微生物学通报，２００６，３３（５）：８４－８８．

［４］ 张霄霖，刘月蝉． 重楼的研究与应用［Ｊ］．中国中医药科技，２０００，７（５）：３４６－３４７．

［５］ 汤海峰，赵越平，蒋永培．重楼属植物的研究概况［Ｊ］．中草药，１９９８，２９（１２），８３９－８４３．

［６］ 马云淑，桂镜生，朱燕，等．滇产重楼资源及市场情况调查［Ｊ］．云南中医学院学报，１９９７，２０（２）：２４－２６．

［７］ ＣＨＥＵＮＧ Ｊ Ｙ， ＯＮＧ Ｒ Ｃ， ＳＵＥＮ Ｙ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌｉｎ Ｄ ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｒ ｉｎ ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］． Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００５（２）：２０３－２１１．

［８］ ＷＡＮＧ ＧＸ， ＨＡＮ Ｊ， ＺＨＡＯ Ｌ Ｗ， ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｈｅｌｍｉｎｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｐａｄｓ ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ［Ｊ］． Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２０１０， １７（１４）： １１０２－１１０５．

［９］ 钟廷瑜，舒光明，易尚平．四川重楼属药用植物资源研究［Ｊ］．资源开发与市场，１９９８，１４（５）：２０２-205．

［１０］ 周浓，段宝忠，夏从龙，等．滇重楼不同生长发育期化学成分的变化规律［Ｊ］．中国实验方剂学杂志，２０１１，１７（５）：７０-73．

［１１］ 李群，陈丽萍， 葛方兰．重楼属植物愈伤组织的诱导和培养［Ｊ］．四川师范大学学报（自然科学版），２００６，２９（１）：１２０－１２２．

［１２］ 杨丽云，陈翠，吕丽芬，等．云南重楼的组织培养与植株再生［Ｊ］．植物生理学通讯，２００８，４４（５）：９４７－９４８．

［１３］ 唐炳兰．中药重楼的研究进展［Ｊ］．右江民族医学院学报，２００６（６）：１０６２－１０６４．

［１４］ 叶芳，夏胜，梅兴国．红豆杉愈伤组织超低温保存有关因素的研究［Ｊ］． 武汉植物学研究，２００１，１９（４）：３２７－３３１．

［１５］ 胡天印，钱丽华，刘汉卿．濒危植物延龄草愈伤组织诱导研究［Ｊ］．浙江师范大学学报（自然科学版），２００６，２９（３）：３２６－３２９．

３小结与讨论

在对华重楼愈伤组织的诱导过程中，笔者发现在适宜的时期选择有效的外植体部位是非常重要的。本研究中所采用的两种根茎外植体都是除去了芽体后保留的第一节的根茎，结果表明，经预处理后的根茎外植体不仅愈伤组织诱导率更高，而且产生的愈伤组织数量也更多，愈伤组织的生长质量也更好，因而也确保了后继愈伤组织的成功增殖；本研究也曾采用了除第一节根茎以外的其他根茎作为外植体进行愈伤组织诱导，但最终都未获得愈伤组织，这也与延龄草（Trillium tschonoskii Maxim.）不同部位根茎诱导愈伤组织的情况相似［１５］；因此，华重楼植物顶芽后的第一节根茎细胞保持有较强的潜在分裂能力，细胞经诱导培养后较易脱分化产生愈伤组织。

薯蓣皂苷作为华重楼植物中的重要有效成分，是属于植物的次生代谢产物。经多次继代培养的华重楼愈伤组织，是可以在产生大量初生代谢产物的基础上，进一步产生薯蓣皂苷次生代谢物；因此，在重楼植物以后的组织培养研究过程中，可有效地通过改变培养基中各成分的种类、比例以及积极开展前体饲喂技术和利用发根农杆菌的遗传转化技术，最终实现利用生物技术生产重楼植物有效成分薯蓣皂苷的目的。

本研究研究了华重楼各部位外植体诱导产生愈伤组织的情况，筛选出了经预处理后的根茎是产生愈伤组织的最佳外植体，并成功地建立了华重楼愈伤组织增殖培养体系，为开展华重楼组培苗的生产和筛选出次生代谢产物含量高的细胞株进行扩大培养奠定了工作基础。

参考文献：

［１］ 李恒．重楼属植物［Ｍ］．北京：科学出版社，１９９８．１－７．

［２］ 国家药典委员会．中国药典一部［Ｚ］．北京：化学工业出版社，２０１０．２４３．

［３］ 张晓洁，查岭生，陈小静，等．一株产重楼皂苷内生细菌的分离与鉴定［Ｊ］．微生物学通报，２００６，３３（５）：８４－８８．

［４］ 张霄霖，刘月蝉． 重楼的研究与应用［Ｊ］．中国中医药科技，２０００，７（５）：３４６－３４７．

［５］ 汤海峰，赵越平，蒋永培．重楼属植物的研究概况［Ｊ］．中草药，１９９８，２９（１２），８３９－８４３．

［６］ 马云淑，桂镜生，朱燕，等．滇产重楼资源及市场情况调查［Ｊ］．云南中医学院学报，１９９７，２０（２）：２４－２６．

［７］ ＣＨＥＵＮＧ Ｊ Ｙ， ＯＮＧ Ｒ Ｃ， ＳＵＥＮ Ｙ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌｉｎ Ｄ ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｒ ｉｎ ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］． Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００５（２）：２０３－２１１．

［８］ ＷＡＮＧ ＧＸ， ＨＡＮ Ｊ， ＺＨＡＯ Ｌ Ｗ， ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｈｅｌｍｉｎｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｐａｄｓ ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ［Ｊ］． Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２０１０， １７（１４）： １１０２－１１０５．

［９］ 钟廷瑜，舒光明，易尚平．四川重楼属药用植物资源研究［Ｊ］．资源开发与市场，１９９８，１４（５）：２０２-205．

［１０］ 周浓，段宝忠，夏从龙，等．滇重楼不同生长发育期化学成分的变化规律［Ｊ］．中国实验方剂学杂志，２０１１，１７（５）：７０-73．

［１１］ 李群，陈丽萍， 葛方兰．重楼属植物愈伤组织的诱导和培养［Ｊ］．四川师范大学学报（自然科学版），２００６，２９（１）：１２０－１２２．

［１２］ 杨丽云，陈翠，吕丽芬，等．云南重楼的组织培养与植株再生［Ｊ］．植物生理学通讯，２００８，４４（５）：９４７－９４８．

［１３］ 唐炳兰．中药重楼的研究进展［Ｊ］．右江民族医学院学报，２００６（６）：１０６２－１０６４．

［１４］ 叶芳，夏胜，梅兴国．红豆杉愈伤组织超低温保存有关因素的研究［Ｊ］． 武汉植物学研究，２００１，１９（４）：３２７－３３１．

［１５］ 胡天印，钱丽华，刘汉卿．濒危植物延龄草愈伤组织诱导研究［Ｊ］．浙江师范大学学报（自然科学版），２００６，２９（３）：３２６－３２９．