1株肠道病毒71型南京分离株的全基因组序列的测定及遗传进化分析

周晋，曹喜华，曹彤，陈红兵

（1.南京医科大学附属南京儿童医院检验科，江苏南京210008；2.南阳医学高等专科学校第一附属医院麻醉科，河南南阳473058）

1株肠道病毒71型南京分离株的全基因组序列的测定及遗传进化分析

周晋1，曹喜华2，曹彤1，陈红兵1

（1.南京医科大学附属南京儿童医院检验科，江苏南京210008；2.南阳医学高等专科学校第一附属医院麻醉科，河南南阳473058）

目的：对肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）南京分离株EV71-NJ2012全基因组核苷酸序列进行测定，并与基因库中的代表性序列进行分析比对。方法：登录基因库，选取不同国家和地区的EV71全基因组序列，设计8对覆盖病毒整个基因组且首尾部分重叠的引物，采用RT-PCR扩增出8个基因片段，通过测序和拼接获得全基因组序列，并与国内外其他EV71分离毒株一起用MEGA 4.0软件进行进化树分析，用DNAStar进行同源性分析。结果：EV71-NJ2012株的基因组长度为7 404 bp，其中5′非编码区（UTR）长742 bp，3′UTR长82 bp，病毒基因组开放阅读框（ORF）全长6 582 bp，编码一个含有2 193个氨基酸残基的多聚蛋白。病毒序列在分型上属于C4a基因型，与上海株的核苷酸同源性最近，而与我国台湾、湖北等分离株的核酸序列差异较大。结论：EV71-NJ2012株基因组的组成和结构符合肠道病毒特征，与上海株亲缘关系最近，而与我国台湾、湖北分离株的差异较为明显。EV71-NJ2012株可能与上海株来源于EV71病毒株的同一种系。

手足口病；肠道病毒71型；序列分析

手足口病是由人肠道病毒引起的一种儿童常见传染病，主要引起发热和手、足、口腔等部位的疱疹，以0.5～4岁的儿童多发，少数患儿可出现神经源性肺水肿、心肌炎、脑膜炎和急性迟缓性麻痹等并发症，严重影响儿童的身体健康［1－3］。该病的流行已有60多年，自1957年新西兰首次报道以来，先后在多个国家和地区暴发和流行。引起手足口病的病原有多种，以肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）和柯萨奇病毒A16型（Cox A16）最为常见。相对而言，EV71能够导致更为严重的神经系统并发症，且其感染率在临床上占据优势［4］。EV71为单股正链RNA病毒，基因组全长约7 400 bp，包含几个顺式作用元件，其中包括5′和3′非编码区（untranslated regions，UTRs），在病毒的复制和翻译中起重要作用。UTRs间是基因组的开放阅读框（open reading frame，ORF），编码2 193个氨基酸组成的结构蛋白前体P1和非结构蛋白前体P2、P3［5］。P1可被加工为衣壳蛋白VP1～VP4，其中VP1区是基因分型的主要依据。

近年来EV71在国内的流行呈上升趋势，以C4基因型为主。这种情况与周边国家和地区有所不同，例如在我国台湾地区EV71病毒的流行有多个不同的型别。在江苏省境内，各个地市每年都能检测到该病毒的发病，比对这些病毒序列后发现，流行的毒株主要属于C4a亚型。这些感染EV71的患者发病情况越来越严重，且越来越多出现神经系统并发症。因此加强对我国EV71流行状况的调查及主要毒株的基因特征分析，对有效防控手口足病的流行具有重要意义。我们对1株肠道病毒71型南京分离株进行了分离和基因组全长测序，并对全长序列进行了遗传进化分析，以期为EV71的基因特征及流行病学研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

Trizol试剂（美国Invitrogen公司）；DL2000 DNA标准参照物、RNA酶抑制剂（TaKaRa公司）；琼脂糖、水饱和酚、氯仿、异丙醇、DEPC（Sigma公司）；MMLV反转录酶（Promega公司）；PCR凝胶纯化回收试剂盒、质粒小提试剂盒和2×Taq PCR酶（北京天根公司）；凝胶成像系统（Bio-Rad公司）。

1.2 标本来源

标本取自南京市儿童医院2012年入院治疗经临床确诊为手口足病并伴发重症脑炎的1例患者粪便及疱疹液样本。经病毒微量中和试验及RT-PCR方法检验确诊后，将该株病毒命名为EV71-NJ2012，置于－70℃保存。

1.3 引物设计及合成

根据基因库中登录的EV71的全基因组序列，用CLUSTAL-W（V1.8）进行序列比对，找出保守区域，设计8对首尾相互重叠且覆盖基因组全长的引物进行扩增（表1）。引物由上海生工生物技术公司进行合成。

表1 EV71-NJ2012全基因组分段扩增引物

1.4 病毒RNA的提取及扩增

病毒样品在Vero细胞进行繁殖后收集病毒，用Trizol试剂进行裂解后提取病毒RNA，最后溶解到DEPC溶液中。然后以病毒RNA为模板分别用表1中的8对引物，分8段用M-MLV反转录酶和PCR酶进行RT-PCR反应，合成病毒cDNA。PCR反应条件为94℃30 s，53℃30 s，72℃1 min，32个循环。产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测确认。

1.5 扩增片段的克隆、测序及遗传进化分析

对经琼脂糖凝胶电泳确认后的8个片段分别进行纯化回收，目的DNA连接至T载体后转化大肠埃希菌DH5α，涂布平板过夜生长后挑取克隆进行质粒提取，获得的质粒送深圳华大基因公司进行测序。测得的序列与基因库中登录的序列进行在线比对进一步确认，然后用CLUSTAL-W（V 1.8）软件进行序列比对，计算核苷酸序列的同源性，用MEGA 4.0软件构建遗传进化树。

2 结果

2.1 PCR产物的扩增及鉴定

从样品中提取病毒RNA，分别用对应的引物进行反转录，获得对应的cDNA片段，以此为模板用设计的引物分别进行PCR扩增，获得覆盖整个EV71病毒株基因组并且相邻片段之间有部分序列相互重叠的基因片段，最后进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。RT-PCR结果表明，用设计的8对引物分别扩增后均得到预计片段大小，扩增片段长度覆盖整个EV71病毒株基因组。

2.2 EV71-NJ2012全基因组序列的测定及分析

将获得的8段PCR产物经纯化回收及克隆到载体上后进行测序，测序结果经序列拼接、比对及分析后获得EV71-NJ2012的全基因组序列。EV71-NJ2012病毒株全基因组序列长度为7 404 bp（不含多聚腺苷酸尾长度），其中碱基A占27.17%，U占24.84%，G占23.81%，C占24.18%，胸腺嘧啶和尿嘧啶含量丰富（A＋U＝52.01%）。其中基因组1～741 bp为5′非编码区，742～7 323 bp为病毒基因组的编码区，编码一个多聚蛋白，最后为病毒的3′非编码区。与其他地区分离的EV71毒株相比，EV71-NJ2012株在中间的多聚蛋白区没有发现核苷酸的插入和缺失，但在5′UTR和3′UTR均发现有核苷酸的插入。

2.3 病毒全基因组序列核苷酸同源性比较

为了进一步分析EV71-NJ2012株与其他EV71型代表性毒株的同源性，对来自国内主要省份及国外代表性毒株基因组不同区段的核苷酸同源性进行了比较。经过分析病毒的基因组结构发现，EV71-NJ2012病毒株无论是在病毒的结构蛋白区域还是在病毒的非编码区（5′UTR和3′UTR），与辽宁、福建及上海株的同源性较高，其中与EV71上海株（收录号：HQ891929）的同源性高达98.2%，与浙江、福建等省份分离的毒株的同源性次之，与湖北分离株（收录号：DQ452074）的同源性为最低（表2）。

表2 EV71-NJ2012株与其他代表性EV71型分离株核苷酸序列的同源性比较 %

2.4 病毒基因组的遗传进化分析

用DNAStar（V 7.0）和CLUSTAL-W（V 1.8）软件进行核苷酸序列比对，用MEGA 4.0软件构建遗传进化树。结果表明，EV71-NJ2012南京分离株与上海分离株在同一进化分支，属于C4a基因型，进一步证实EV71-NJ2012南京分离株与上海分离株的亲缘关系（图1）。

3 讨论

EV71属于小RNA病毒科肠道病毒属，基因组全长7 400 bp左右，为单股正链RNA病毒。2008年以来，EV71型的感染在我国呈暴发趋势，并且在多个省份出现病例死亡的报道。为了解南京地区近年来EV71型毒株的病原特征，我们对2012年分离到的1株EV71型病毒株进行了全基因组序列的测定及同源性分析，并绘制了遗传进化树，对病毒序列进行亲缘关系分析，以期了解南京分离株的遗传进化关系。

图1 EV71-NJ2012南京分离株全基因组序列的遗传进化树

经全基因组序列的测定及分析，发现该病毒分离株多聚蛋白区域比较保守，没有核苷酸及氨基酸的插入和缺失，但是非编码区基因的变异较为明显，这与国内其他省份的报道相符［6－7］。南京地区分离的EV71型病毒株EV71-NJ2012为C4a亚型，与近年来国内主要流行毒株基因型一致。在核苷酸的同源性方面，EV71-NJ2012病毒株与上海、福建、辽宁、浙江及广西分离株有较高的同源性，其中与上海分离株的同源性最高，同属于C4基因型。这说明分离到的病毒株较为稳定，没有发生较大的变异。南京与上海有较近的地缘，人员往来较为频繁，为病毒在两地的快速传播提供了便利条件。分段序列比对发现，EV71-NJ2012病毒株的结构蛋白P1区与上海株的同源性最近，但是对P2和P3非结构蛋白区域的序列分析表明，EV71-NJ2012病毒株与浙江株有较近的亲缘关系。

中国大陆地区EV71的流行多以C4为主，在感染的初期多表现为隐性感染，这给手口足病的监测和防控带来了一定的困难。目前针对该病尚无有效的疫苗和药物，因此加强预防和监测，掌握其分子流行病学特征和病原学特征，对防控本病显得尤为重要。本研究对南京市1例手口足病患者的病毒分离株进行了全基因组序列的测定及遗传进化分析，结果表明该病毒株属于C4a基因型，为我国EV71病毒基因库积累了相关资料，也为以后疫苗的研制、诊断试剂的开发及防控策略的制定提供了重要参考。

［1］随素敏，都鹏飞.机械通气治疗重症手足口病合并急性肺水肿10例临床分析［J］.安徽医学，2009，30（3）：260－261.

［2］张凤华.手足口病并病毒性脑膜炎及心肌损害18例临床观察［J］.中国医药导报，2008，5（17）：183.

［3］初忠侠.儿童手足口病合并病毒性心肌炎28例分析［J］.中国误诊学杂志，2011，11（7）：1718.

［4］Zheng ZM，He PJ，Caueffield D，et al.Enterovirus 71 isolated from China is serologically similar to the prototype E71 BrCr strain but differs in the 5′-noncoding region［J］.JMed Virol，1995，47（2）：161－167.

［5］Fujita K，Krishnakumar SS，Franco D，et al.Membrane topography of the hydrophobic anchor sequence of poliovirus 3A and 3AB proteins and the functional effect of 3A／3ABmembrane association upon RNA replication［J］.Biochemistry，2007，46（17）：5185－5199.

［6］马元鹏.肠道病毒71型VP1基因和5′非编码区核酸序列分析［D］.郑州大学，2011.

［7］涂智杰，胡芹，曹金萍，等.肠道病毒71型景德镇分离株全基因组序列分析［J］.军事医学，2013，37（1）：69－72.

Sequence and phylogenetic analysis of an enterovirus71 strain isolated in Nanjing

ZHOU-Jin1，CAO Xi-hua2，CAO Tong1，CHEN Hong-bing1
（1.Department of Clinical Laboratory，Children′s Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Nanjing Jiangsu 210008；2.Department of Anesthesiology，the First Affiliated Hospital of Nanyang Medical College，Nanyang Henan 473058，China）

Objective：To sequence and analyze the complete genome of an enterovirus 71 isolate（EV71-NJ2012）isolated in Nanjing（2012），and to compare the sequences deposited in GenBank.M ethods：According to the genome information from GenBank，8 pairs of primerwere designed to cover thewhole genome.The genome sequences were determined by RT-PCR sequencingmethod，and the sequences were analyzed using bioinformatic software（MEGA 4.0 and DNAStar）.Results：The full genomic length of EV71-NJ2012 was 7 404 bp，which contained 5′UTR（742 bp），the open reading frame（ORF，6 582 bp）and 3′UTR（82 bp）.The ORF encoded a polyprotein with 2 193 amino acid residues.The viral sequences belong to the sub-type C4a genotype and had themaximum homology with Shanghai isolate，however，its sequencewas quite differentwith the Taiwan and Hubei isolates.Conclusion：The genome structure of EV71-NJ2012 strain is consistentwith enterovirus.The phylogenetic relationships of the EV71-NJ2012 strain with other EV71 strains are different.EV71-NJ2012 strain has themaximum sequence homology with Shanghai isolate，and is quite different with the Taiwan and Hubei isolates.It maybe infer that EV71-NJ2012 and Shanghai strains probably originate from the same EV71 strain.

hand-foot-mouth disease；enterovirus 71（EV71）；sequence analysis

周晋（1985—），男，江苏南京人，技师，主要研究方向为病原学；陈红兵（通讯作者），E-mail：115468172＠qq.com

R373.25

A

1671－7783（2014）04－0312－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140159

2014－04－29 ［编辑］陈海林