应用福爱乐医用胶粘贴法构建人胃癌组织块原位移植模型

张杰，贾丽娟，梁冰，步雪峰

（1.江苏大学附属人民医院普外科，江苏镇江212002；2.江苏大学临床医学院，江苏镇江212001）

应用福爱乐医用胶粘贴法构建人胃癌组织块原位移植模型

张杰1，2，贾丽娟2，梁冰2，步雪峰1

（1.江苏大学附属人民医院普外科，江苏镇江212002；2.江苏大学临床医学院，江苏镇江212001）

目的：利用福爱乐医用胶构建人胃癌组织块裸鼠原位移植模型，为研究胃癌的病理生理过程及实验研究提供理想的动物模型。方法：以人胃癌SGC-7901细胞株反复接种传代于BALB／C裸鼠皮下形成的皮下移植瘤组织块为材料，利用福爱乐医用胶将其粘贴在30只裸鼠胃大弯侧浆膜下，分别在术后4、6、8周随机取10只裸鼠观察原位移植瘤的生长状况、移植成功率及转移情况。结果：原位移植瘤成瘤率为100%。随着饲养时间的延长，胃癌腹腔淋巴结转移、肝脏黏连等出现率逐渐增高。结论：利用福爱乐医用胶粘贴法能够安全、便捷地建立人胃癌裸鼠原位移植瘤模型，并可模拟胃癌的临床发生发展过程。

胃癌；原位移植模型；医用胶

胃癌的浸润与转移是影响患者治疗和预后的重要因素，因此建立一种能体现人体胃癌侵袭和转移方式的理想动物模型是研究胃癌发病机制及治疗方法的重要前提［1］。20世纪90年代初期Furukawa等［2］将完整组织块原位缝挂于裸鼠浆膜损伤的胃壁（缝挂法）建立的人胃癌移植模型较Yamaguchi等［3］将胃癌AZL5G细胞株制成单细胞悬液接种于裸鼠胃壁内建立的人胃癌移植模型成瘤率高。到20世纪90年代末期，汪芳裕等［4］又采用裸鼠胃壁缝制黏膜小囊包埋肿瘤组织块（胃囊法）制成胃癌移植模型。近年来，利用OB生物医用胶构建的裸鼠胃癌原位模型得到了普遍的应用［5］。这种方法的主要优势在于裸鼠创伤小、成瘤率高、成瘤周期短，不易引起裸鼠消化道梗阻等。福爱乐（FAL）医用胶在普通医用胶的基础上提高了单体纯度，优化了普通医用胶的综合性能，使医用胶在许多科室成为必用品，并发展成为医用胶治疗学［6］。本实验中，我们采用FAL医用胶构建人胃癌组织块裸鼠原位移植模型，成瘤率达到100%，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

4周龄BALB／C雄性裸鼠40只，体质量14～16 g，购于扬州大学医学比较中心，动物合格证号为［SCXK（苏）2012－0004］，SPF级条件下饲养。传代于裸鼠皮下的人胃癌SGC-7901细胞系由本实验室冻存传代。FAL医用胶购于北京福爱乐医用胶研究所，批号20110306。胎牛血清（FBS）和无血清培养液DMEM为美国Gibco公司产品。

1.2 方法

1.2.1 裸鼠皮下瘤的种植和传代 10只裸鼠用作皮下瘤传代。收集体外培养的SGC-7901细胞，制成5×107／mL的细胞悬液，用1 mL无菌注射器在2只裸鼠右侧腋下皮下注射0.2mL的细胞悬液，形成皮丘。约30 d皮下瘤长径达1 cm，此时在无菌条件下取出皮下瘤，去除外周皮下组织、结缔组织，PBS洗涤后用眼科剪剪成约1 mm×1 mm×1 mm。将这些瘤组织块在另2只裸鼠腋下皮下移植，如此反复成瘤移植4代。

1.2.2 原位移植瘤模型的建立 30只裸鼠用作胃癌原位移植瘤模型的构建。待上述形成第4代皮下移植瘤的裸鼠皮下瘤直径达1 cm时用于原位移植。移植前1天原位移植裸鼠禁食。无菌操作下取出第4代皮下瘤，剪成约1 mm×1 mm×1 mm的组织块，浸润在PBS中待用。待移植的裸鼠用氯胺酮70 mg／kg腹腔注射麻醉，取仰卧位，固定四肢，铺无菌洞巾，腹部皮肤以碘附消毒，腹部左正中切口进腹。无菌棉球填塞胃后方，显露胃大弯，用无菌1 mL注射器针头在胃大弯侧挑破胃浆膜，将粘有FAL医用胶的皮下瘤组织块贴在胃浆膜挑破处，约5 s后组织块即可与胃浆膜粘贴，检查确认组织块粘贴处无出血，然后将胃还纳入腹腔，取出填塞的棉球，6－0缝合线关腹（腹膜，肌层，皮肤）。腹部切口再次以碘附消毒，涂抹金霉素眼膏防止感染。

1.2.3 胃癌原位移植瘤成瘤率、移植瘤转移和浸润情况 原位移植术后继续在SPF级条件下饲养，定时观察裸鼠的运动、饮食情况和腹部体征。分别在原位移植术后4、6、8周对小鼠进行B超检查。然后随机处死10只裸鼠，开腹探查移植瘤位置、大小、有无与周围器官黏连、转移情况、有无腹腔积液。取出原位瘤、肝脏、肿大淋巴结，采用10%甲醛固定保存，石蜡包埋，制切片行HE染色，倒置显微镜下观察病理组织学结构。

2 结果

2.1 原位移植瘤裸鼠生长情况

移植术后4周裸鼠左上腹可触及直径约6 mm的硬质肿块，超声影像显示胃大弯处椭圆形低回声光团，边缘规整，内部回声尚均匀。术后6周裸鼠左上腹可触及直径约10 mm的硬质肿块，超声影像基本与术后4周相似，只是低回声光团增大，内部回声欠均匀。术后8周时裸鼠左上腹可触及直径约17 mm的硬质肿块，肉眼即可在裸鼠左侧腹部看见肿块，B超显示低回声光团比6周时增大，形态不规则，边缘不规整，可见部分囊性坏死。随着时间的延长，裸鼠活动能力呈进行性下降，饮食亦逐渐减少。术后4、6、8周裸鼠腹部超声影像见图1。

图1 原位移植瘤术后不同时间裸鼠腹部B超检查结果

2.2 大体病理

肉眼可见胃底胃大弯侧灰白色肿瘤组织，触及质地较硬，肿块表面呈不规则结节样。30个原位移植瘤成瘤率为100%。在3个不同时间点观察到原位移植瘤大体病理切面均呈灰白色鱼肉样。瘤体直径4周时平均为（6±0.53）mm，6周时为（10± 1.35）mm，8周达（17±2.06）mm。裸鼠在8周时出现腹腔积液。随着术后时间的延长，淋巴结转移逐渐增多，移植瘤模型表现与临床胃癌的病理生理行为极为相似。

2.3 组织病理

光镜下胃癌原位移植瘤组织内见到大量排列紊乱呈类圆形、核胞比增大、核大深染、多呈分裂象的细胞替代正常腺体组织。肝脏内未见转移癌细胞。腹腔内淋巴结转移灶见肿瘤细胞浸润性生长，与原位移植瘤在组织形态学上相似。见图2。

图2 原位移植瘤、肝脏、腹腔转移淋巴结病理组织（HE染色）

3 讨论

建立人胃癌组织块原位移植瘤模型的目的是能够最大限度地模拟胃癌的病理生理过程。理想的胃肿瘤动物模型应具备以下条件：①致癌方法简单易行；②经济快速；③指标客观明确；④对癌变器官的特异性高；⑤重复性好；⑥诱发肿瘤的病理类型、生物学行为、电镜下表现及组织化学改变应与人体肿瘤相似［7］。

长期的研究发现，与癌细胞悬液原位移植模型比较，胃癌组织块原位移植模型具有更高的移植成功率及转移率［8］。癌细胞悬液原位移植成瘤率和转移率较低，可能是因为经胰酶消化处理后，肿瘤细胞的生长与转移受到一定影响。肿瘤组织块原位移植具有原位移植和保持癌组织的完整结构的优点，所以原位移植成功率、转移率、荷瘤鼠中位生存期等指标都较高。近些年普遍使用OB胶粘贴法构建原位移植瘤，操作简单，术中出血少，术后恢复快，明显提高了裸鼠存活率，并且保持了癌组织的完整结构，避免了细胞表面结构遭到破坏而导致恶性肿瘤生物学行为和自然属性、恶性程度的改变，更好地模拟了临床肿瘤发生过程［9］。但是OB胶不易被组织吸收，在肿瘤模型中可能影响肿瘤组织的外生性生长，在原位移植瘤的生长过程中容易使肿瘤中心大量坏死［10］。

本次实验中人胃癌原位移植瘤模型的构建依旧采用粘贴法，但应用的是FAL医用胶。FAL医用胶是一种人工合成、无色透明的α-氰基丙烯酸正辛酯（NOCA）和α-氰基丙烯酸正丁酯（NBCA）组成的生物医学工程材料，两种单体的纯度均在99%以上，聚合热低，体外聚合速度适当，连接强度大，在阴离子（体液、血液）作用下，扩散性好，3～5 s即可固化成与人体组织韧性相近的薄膜。该胶喷涂在体内脏器表面后2～4周即可降解吸收并排出体外。多种动物实验、多器官试验显示无致畸、致癌、促癌、染色体畸变等损害［11］。原位瘤组织大体切面见鱼肉样灰白，未见坏死，组织HE染色未见坏死，这一点明显优于OB胶。临床上胃癌淋巴转移为主要转移途径，早期可出现，血行转移出现于晚期。本次实验中移植瘤模型裸鼠腹腔内淋巴结转移率术后6周时为40%，8周为70%，未见肝脏转移，符合胃癌的临床特点。

为了方便而有效地研究胃癌的发生发展规律，使用裸鼠动物模型是一个极为重要和有效的实验手段，胃癌模型构建方法的不断改进，将为胃癌的研究提供更好的手段。

［1］陈云逸.胃癌动物模型研究进展［J］.肿瘤基础与临床，2006，19（1）：75－76.

［2］Furukawa T，Kubota T，Watanabe M，et al.Differential chemosensitivity of local and metastatic human gastric cancer after orthotopic transplantation of histologically intact tumor tissue in nudemice［J］.Int JCancer，1993，54（3）：397－401.

［3］Yamaguchi K，Ura H，Yasoshima T，et al.Liver metastaticmodel for human gastric cancer established by orthotopic tumor cell implantation［J］.World J Surg，2001，25（2）：131－137.

［4］汪芳裕，朱人敏，王琳，等.裸鼠人胃癌原位移植模型的建立［J］.癌症，1997，16（5）：343－344.

［5］Shi J，Wei PK，Zhang S，et al.OB glue paste technique for establishing nudemouse human gastric cancer orthotopic transplantation models［J］.World JGastroenterol，2008，14（30）：4800－4804.

［6］田霞，卢永顺.福爱乐医用胶（FAL）及其应用［J］.国际外科学杂志，2006，33（1）：74－75.

［7］吴细丕，钱林法.实验动物与肿瘤研究［M］.北京：中国医药科技出版社，2000：190－199.

［8］Illert B，Otto C，Braendlein S，et al.Optimization of a metastasizing human gastric cancer model in nude mice［J］.Microsurgery，2003，23（5）：508－512.

［9］陈亚琳，魏品康，许玲，等.采用OB胶粘贴法建立人胃癌裸鼠原位种植转移模型［J］.癌症，2005，24（2）：246－248.

［10］李莹杰，贺岩，王齐敏，等.优化胶粘贴法建立裸鼠胃癌原位种植模型［J］.中国实验动物学报，2007，15（5）：369－371.

［11］夏穗生，田霞，卢永顺.新一代喷涂型福爱乐医用胶：基础研究［J］.临床外科杂志，2003，11（2）：120－121.

Application of FAL medical glue in establishing the human gastric cancer tissuemass orthotopic transplantation model

ZHANG Jie1，2，JIA Li-juan2，LIANG Bing2，BU Xue-feng1
（Department of General Surgery，the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002；2.School of Clinical Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To establish nudemouse orthotopic transplantationmodel of human gastric cancer tissuemass by FALmedical glue for the study of pathophysiological process of gastric cancer and experimental study to provide an ideal animalmodel.M ethods：Transplanted gastric cancer tissuemasswas constructed through repeatedly subcutaneously inoculating and passaging human gastric cancer cell line SGC-7901 in BALB／C nudemouse，and pasted orthotopically on the greater curvature by FALmedical glue.The orthotopic transplantation tumor growth characteristics，and success rate of transplantion andmetastasis ratewere examined.Results：Orthotopic transplantation tumor ratewas 100%by thisway.As the extension of feeding time，lymph nodemetastasis，liver adhesion rate increased gradually.Conclusion：Using FALmedical glue can safely and conveniently establish human gastric cancer nudemouse orthotopic transplantation tumor model，and simulated gastric cancer clinical development asmuch as possible.

gastric cancer；orthotopic transplantation model；medical glue

R541.75

A

1671－7783（2014）04－0287－03

10.13312／j.issn.1671-7783.y140023

镇江市社会发展基金资助项目（JLY2010005）；江苏大学临床医学科技发展基金资助项目（JLY2010005）

张杰（1987—），男，硕士研究生；步雪峰（通讯作者），主任医师，硕士生导师，E-mail：xuefengbu05＠163.com

2014－02－10 ［编辑］陈海林