气相色谱-串联质谱法快速测定乳制品中三聚氰胺及其3种类似物

林晓珊，吴惠勤，黄晓兰，马叶芬，朱志鑫，黄 芳，罗辉泰，邓 欣

(中国广州分析测试中心，广东省分析测试技术公共实验室，广东 广州 510070)

三聚氰胺(melamine，CAS号：108-78-1)是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，是重要的氮杂环有机化工原料，常用于制造三聚氰胺树脂。在三聚氰胺制造过程中产生的杂质可能会形成三聚氰酸(cyanuric acid)、三聚氰酸一酰胺(ammeline)和三聚氰酸二酰胺(ammelide)等类似物，一些不法分子利用其含氮量高，将其添加到乳制品中以提高氮含量。2007年爆发的猫和狗等宠物食品事件，2008年爆发的三鹿奶粉事件都是因违法添加三聚氰胺导致的。目前，三聚氰胺已严禁直接用于食品。三聚氰胺和三聚氰酸虽然只有低急性毒性，但有证据显示，在同时摄入三聚氰胺和三聚氰酸后会导致肾毒性。研究人员试验了大鼠单独摄入三聚氰胺或其类似物的1种、三聚氰胺和三聚氰酸的混合物，以及4种化合物的混合物，发现单独摄入均未对肾产生任何副作用，但摄入混合物则产生明显的肾损伤[1]。因此，在乳制品中同时检测三聚氰胺及其3种类似物非常重要。

目前，对三聚氰胺及其同系物检测方法的报道主要针对生鲜乳、猪组织、食品以及食品添加剂等样品，多采用液相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法等[2-16]，但都存在一定的缺陷。如王炼等[15]利用超高效液相色谱法测定乳及乳制品中三聚氰胺，该方法只针对三聚氰胺一种成分，且只用保留时间定性。朱聪英等[16]利用GC/MS法同时测定生鲜乳中三聚氰胺及其类似物，4种化合物的检出限为0.1～0.2 mg/kg，且所采用的选择离子(SIM)法仅适合基体简单的生鲜乳，而对于基质较复杂的乳制品，则干扰较大，会造成灵敏度不够，影响结果的准确性。

由于三聚氰胺及其3种类似物中包含了酸性和碱性化合物，较难用单一的固相萃取小柱净化，而且乳制品基质成分较复杂，给色谱分离和硅烷化处理带来了困难，即使采用选择离子检测法也难以消除，影响了测定的准确度，易产生假阳性。本研究采用气相色谱-三重四极杆串联质谱(GC-MS/MS)技术，通过“母离子>子离子”的多反应监测模式(MRM)，快速测定乳制品中的三聚氰胺及其3种类似物。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 7000A三重四极杆气相色谱-串联质谱仪：美国Agilent公司产品；氮吹仪：上海安谱科学仪器有限公司产品；TDL-80-2B低速台式离心机：上海飞鸽牌产品。

三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺：德国CNW Technologies GmbH公司产品；乙腈(色谱纯)：德国Merck公司产品；二乙胺、三氯乙酸、乙酸锌、吡啶(分析纯)：广州化学试剂厂产品；硅烷化试剂(含有1%三甲基一氯硅烷(TMCS)的N,O-双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA))：上海安谱科学仪器有限公司产品；实验用水为蒸馏水；乳制品(奶粉、液态奶、酸牛奶、含乳饮料、奶茶、炼乳、奶酪)：均购自超市。

1.2 标准工作溶液的制备

准确称取10.0 mg(精确至0.1 mg)标准物质，用V(二乙胺)∶V(水)=20∶80的溶液超声溶解，并定容至100 mL容量瓶中，配制成浓度为0.1 g/L混合标准储备溶液，在-18 ℃以下冷冻，避光保存，有效期3个月。实验需要时，准确移取一定体积的混合标准储备溶液，用V(二乙胺)∶V(水)∶V(乙腈)= 10∶40∶50的溶液稀释成0.01、0.02、0.04、0.1、0.2、0.4、1.0 mg/L系列浓度混合标准工作溶液。

1.3 样品前处理

1.3.1 提取 称取0.5 g(精确至0.001 g) 试样于50 mL具塞离心管中,加入20 mL提取溶剂，涡旋1 min，超声提取30 min，然后以4 000 r/min离心5 min，取200 μL上层清液于10 mL尖底具塞玻璃比色管中，70 ℃下经氮气吹干。

1.3.2 衍生化 向吹干后的比色管中加入300 μL吡啶和200 μL硅烷化试剂，超声振荡1 min，涡旋1 min后，于70 ℃衍生45 min，衍生化的溶液进行GC-MS/MS分析。混合标准工作溶液按上述步骤同时进行衍生。

1.4 GC-MS/MS分析

1.4.1 色谱条件 色谱柱： HP-1MS弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气：He(99.999%)；碰撞气为 N2；柱流量0.9 mL/min，恒流；不分流进样；进样量1.0 μL；进样口温度280 ℃；升温程序：柱初始温度70 ℃，保持1 min，以10 ℃/min至280 ℃，保持8 min。

1.4.2 质谱条件 EI离子源，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，色谱-质谱连接口温度280 ℃，电子能量70 eV，电子倍增器电压1 500 V，溶剂延迟时间6 min，MRM扫描模式。选择母离子、子离子、碰撞能量及保留时间列于表1。

表1 母离子、子离子、碰撞能量及保留时间

注：*定量离子对

1.4.3 测定方法 各取1.0 μL样品溶液和标准溶液注入气相色谱-串联质谱仪进行分析，得到GC-MS/MS的MRM图。以保留时间和二级质谱特征碎片离子定性，以定量离子对的峰面积外标法计算样品中三聚氰胺及其3种类似物的含量。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的选择

2.1.1 提取方法的选择 现有的检测方法只针对三聚氰胺一种物质，一般采用阴离子固相萃取小柱净化，前处理步骤较为繁琐。而乳制品中三聚氰胺及其3种类似物的基质较复杂，对提取溶剂要求较高，本研究进行了3种方法的比较。1)用水稀释或溶解样品，以V(1%三氯乙酸)∶V(乙腈)=75∶25的溶液超声提取，沉淀蛋白效果好，加标回收率在72%左右；2)用水稀释或溶解样品，以22 g/LV(乙酸锌)∶V(乙腈)=75∶25的溶液超声提取，沉淀蛋白效果好，加标回收率在68%左右；3)用V(二乙胺)∶V(水)∶V(乙腈)=10∶40∶50 的溶液超声提取，破坏了三聚氰胺及其3种类似物可能同时存在的离子对，提高了目标物的溶解度，加标回收率大于92.5%。本研究选择方法(3)作为提取溶剂。

2.1.2 提取溶剂用量及衍生条件的选择 由于样品基质较复杂，本研究考察了样品量、提取溶剂用量及衍生条件对定量结果的影响。称取2组空白样品进行加标回收实验，称样量为0.5、1.0 g，分别加入5、10、15、20、25、30 mL提取液，对比吸取100、200、300、400、500 μL上清液，进行氮吹浓缩和硅烷化衍生，比较结果列于表2。

结果表明：1)称样量增大时，本底干扰大，基质复杂，回收率降低；2)随着提取溶剂的增多，回收率有所增加，用20 mL提取溶剂基本能够提取完全，且提取溶剂较为澄清；3)取提取溶剂氮吹浓缩时，溶剂量越大，本底干扰越大，浓缩越难，对硅烷化衍生影响较大，使回收率降低。综上，本实验选择取样量为0.5 g，提取溶剂为20 mL，离心后，吸取200 μL上清液进行氮吹浓缩和硅烷化衍生。

2.2 色谱条件的选择

目标化合物进行硅烷化衍生后极性较弱，采用AB-5MS弱极性柱，通过改变起始温度、程序升温速率和柱流量等参数，筛选出最佳的色谱条件，使目标化合物的峰形好、出峰快、流失小，三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺能完全达到基线分离。

表2 前处理条件比较结果

2.3 GC-MS/MS质谱条件的优化

通过全扫描确定三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺衍生物的质谱图，三聚氰胺以m/z342和m/z327作为母离子，三聚氰酸以m/z345和m/z330作为母离子，三聚氰酸一酰胺以m/z344和m/z329作为母离子，三聚氰酸二酰胺以m/z343和m/z328作为母离子，进行子离子扫描，其特征离子图示于图1。通过对碰撞能量5、10、15、20、25、30、35、40、45 V进行优化，三聚氰胺及其3种类似物优化后的MRM参数已在表1中列出。采用 MRM模式，消除了乳制品中复杂基质的干扰，提高了检测的灵敏度及准确度。

注：a．三聚氰胺；b．三聚氰酸；c．三聚氰酸一酰胺；d．三聚氰酸二酰胺 图1 三聚氰胺及其3种类似物的特征离子图 Fig.1 Characteristic ion chromatogram of melamine and its three analogues

2.4 基质效应

分别取各种乳制品样品(奶粉、液态奶、酸牛奶、含乳饮料、奶茶、炼乳、奶酪)，按1.3.1方法进行提取后，用此提取液配制标准溶液，按1.3.2方法进行衍生化处理，GC-MS/MS进样分析，以其色谱峰峰面积与相应浓度标准溶液(纯溶剂配制)的色谱峰峰面积的比值为基质效应。结果表明，基质效应影响不大，可忽略。

2.5 方法学验证

2.5.1 检出限及定量限 在空白奶粉样品中添加一定浓度的标准溶液，测定检出限及定量限。按3倍信噪比计算，三聚氰胺及其3种类似物的检出限均达到0.05 mg/kg；按10倍信噪比计算，定量限均达到0.1 mg/kg，能满足乳制品中三聚氰胺及其3种类似物的限量要求。

2.5.2 标准曲线及线性范围 配制0.01、0.02、0.04、0.1、0.2、0.4、1.0 mg/L三聚氰胺及其3种类似物的混合标准系列溶液，衍生化后进行测定，以峰面积y为纵坐标，质量浓度x(mg/L)为横坐标，绘制标准工作曲线。三聚氰胺及其3种类似物的混合标准溶液的GC-MS/MS图示于图2。在0.01～1.0 mg/L范围内，三聚氰胺及其3种类似物的线性关系均良好，线性回归方程及相关系数列于表3。

2.5.3 回收率及精密度 在空白奶粉样品中加入混合标准工作溶液，使样品加标水平分别为0.5、1.0、2.0 mg/kg，每个加标水平进行6次平行测定，按1.3处理样品后，同时测定三聚氰胺及其3种类似物的含量，计算回收率和精密度。3个添加水平的回收率为92.5%～102.5%，相对标准偏差(RSD)为2.5%～5.0%，结果列于表4。该方法的准确度和精密度均较高，且具有较好的可靠性和重现性。

注：a．三聚氰胺；b．三聚氰酸；c．三聚氰酸一酰胺；d．三聚氰酸二酰胺图2 三聚氰胺及其3种类似物的GC-MS/MS图Fig.2 Chromatogram of melamine and its three analogues by GC-MS/MS

2.6 实际样品的测定

采用本研究建立的GC-MS/MS方法对购自超市的乳制品(奶粉、液态奶、酸牛奶、含乳饮料、奶茶、炼乳、奶酪)进行分析，结果表明，在1种奶粉和1种液态奶中检出三聚氰胺，含量分别为0.89 mg/kg和1.75 mg/kg，未超过国家限量标准2.5 mg/kg；在所有样品中均未检出三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺，基质标样(0.1 mg/L)的质谱图示于图3。

表3 三聚氰胺及其3种类似物的
线性方程和相关系数
Table 3 The linear equations and correlation
coefficients of melamine and its three analogues

组分名称线性方程相关系数三聚氰胺y=2 936 173x-23 8210.999 8三聚氰酸y=2 898 483x+114 3500.998 2三聚氰酸一酰胺y=4 239 414x-33 9180.999 9三聚氰酸二酰胺y=6 167 243x-64 4530.999 8

注：a．三聚氰胺；b．三聚氰酸；c．三聚氰酸一酰胺；d．三聚氰酸二酰胺图3 基质标样的GC-MS/MS图 Fig.3 GC-MS/MS multiple-reaction monitoring(MRM) chromatography of the matrix samples

组分名称加入量/(mg/kg)实测值/(mg/kg)回收率/%相对标准偏差/%0.50.44,0.45,0.47,0.48,0.49,0.4893.64.14三聚氰胺1.00.92,0.93,0.89,0.95,0.96,0.9092.52.962.01.85,1.92,1.95,1.98,1.93,1.8695.82.660.50.43,0.48,0.46,0.44,0.47,0.4892.64.02三聚氰酸1.00.95,0.91,0.97,0.92,0.96,0.9394.02.522.02.09,2.11,2.10,1.98,1.97,2.07102.53.030.50.47,0.48,0.45,0.47,0.44,0.4792.73.25三聚氰酸一酰胺1.00.95,0.94,0.86,0.97,0.98,0.9293.74.612.01.93,1.87,1.97,1.92,1.96,1.8595.82.500.50.48,0.44,0.50,0.47,0.44,0.4793.35.00三聚氰酸二酰胺1.00.92,0.93,0.95,0.97,0.96,0.9095.32.722.01.95,1.98,1.99,2.02,1.94,1.8797.92.65

3 结论

通过对样品前处理条件和质谱条件进行优化，采用V(二乙胺)∶V(水)∶V(乙腈)=10∶40∶50的溶液提取样品中待测物，提取液经氮吹仪浓缩后，用硅烷化试剂衍生，GC-MS/MS法测定。结果表明：该方法简便、快速，无需小柱，具有保留时间和串联质谱特征离子对确证的优点；并且准确可靠，灵敏度高，节省了样品的前处理时间及成本。方法的选择性好、信噪比高，检出限为0.05 mg/kg，定量限为0.1 mg/kg，能满足同时测定三聚氰胺及其3种类似物的要求。

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