用HPLC-MS法测定异叶天南星中L-瓜氨酸的含量

吴丽群

(福建生物工程职业技术学院实训实验中心，福州 350002)

天南星为天南星科天南星属植物天南星Arisaemaerubescens(wal1.)Schott、异叶天南星ArisaemaheterophyllumBl.或东北天南星ArisaemaamurenseMaxim.的干燥块茎，其性温，气微辛，味苦，具有燥湿化痰、祛风止痉等功效，临床用于治疗顽痰咳嗽、胸膈胀闷、中风、口眼歪斜等疾病。目前发现天南星含有多种化学成分，如黄酮类、多糖类、氨基酸类等[1,2]。其中L-瓜氨酸是主要的生理活性物质，具有增强免疫、促进血液循环、抗衰老、提高男性性功能等重要作用[3]。其分析方法主要有液相色谱法[4，5]、酶法[6]、分光光度法[7]和气质联用法[8]。分光光度法测定L-瓜氨酸需要脱色，显色过程不易控制。以2，4-二硝基氟苯为衍生剂的液相色谱法测定L-瓜氨酸，虽然方法灵敏、 重复性好，但衍生物见光易分解。目前关于L-瓜氨酸的HPLC-MS检测方法国内尚未见报道。本研究建立的HPLC-MS法测定异叶天南星中L-瓜氨酸的含量，操作简便，适用范围广，结果具有良好的线性、准确度和重现性。

1 仪器和试药

1.1 仪器 Agilent 6410液相色谱与串联三重四级杆质谱联用仪(美国Agilent公司)；KQ2200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。225D十万分之一电子天平(德国赛托利斯公司)

1.2 药品和试剂 异叶天南星 (批号130401、130702、140304， 四川辅正药业有限公司， 经福建生物工程职业技术学院药学系杨晖副教授鉴定为正品)；L-瓜氨酸对照品 (含量≥98%， 中国药品生物制品检定研究院， 批号 0875-200205)；乙腈(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司，批号 T2009030)；甲酸(分析纯，上海试一化学试剂有限公司，批号 080108)；盐酸(分析纯，泉州东海试剂有限公司，批号 0909115)。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 色谱柱: Ultimate AQ-C18柱(100 mm×4.6 mm，3 μm)；流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液(13∶87)；流速：0.3 ml/min；柱温：30 ℃。

2.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，源喷射电压：2500 V；离子源温度：350 ℃；采用正离子多反应监测模式检测。用于定量分析的离子L-瓜氨酸m/z176→70，裂解电压：75 V，碰撞能量：30 eV。

2.3 溶液的配制 (1)对照品储备液：精密称取L-瓜氨酸对照品19.60 mg，用150 ml去离子水溶解并定容至200 ml，摇匀，配制成浓度为98 μg/ml的L-瓜氨酸对照品储备液，置4 ℃冰箱保存备用。(2)供试品溶液：取异叶天南星适量，粉碎，过60目筛。精密称定细粉3 g，置具塞锥形瓶中，加入10倍量的0.1 mol/L盐酸溶液，超声提取3次，每次30 min，合并上清液，70 ℃水浴浓缩，过滤，定容至50 ml，作为样品溶液。

2.4 专属性考察 对照品溶液(A图)及供试品溶液(B图)的HPLC-MS谱图见图1。结果表明，溶剂在与对照品相同保留时间的位置上，无相应的色谱峰出现，说明其他组分不干扰L-瓜氨酸成分的测定。

图1 异叶天南星的HPLC-MS谱图

2.5 线性关系的考察 精密吸取L-瓜氨酸对照品储备液，配制成浓度为0.019 1、0.076 5、0.306 3、1.225 5、2.451 1、4.902 2、9.804 3 μg/ml的对照品溶液，分别注入HPLC-MS仪，按2.1及2.2项下条件测定峰面积，记录色谱图；以对照品峰面积(A)为纵坐标，浓度(c)为横坐标，绘制标准曲线，线性回归方程为：A=5 039.3c-371.99，r=0.999 3(n=7)，L-瓜氨酸在0.019 1～9.804 3 μg/ml范围内呈良好的线性关系。

2.6 精密度实验 精密吸取浓度为9.804 3 μg/ml的对照品溶液，按照2.1及2.2项下条件，连续进样6次，测得对照品中L-瓜氨酸平均峰面积的RSD为2.27%(n=6)，表明精密度良好。

2.7 重复性实验 取异叶天南星样品(批号130401)，按2.3项下(2)方法平行制备6份供试品溶液，按2.1及2.2项下条件进行测定，结果L-瓜氨酸平均含量的RSD为2.64%(n=6)，表明方法重复性良好。

2.8 稳定性实验 精密吸取异叶天南星供试品溶液5 μl，在同一条件下分别于0、1、2、6、8、12 h 进样，测得平均峰面积的RSD为0.94%(n=6)，表明供试品溶液在室温条件下12 h内稳定，能满足含量测定要求。

2.9 加样回收率实验 精密称取已知含量的异叶天南星样品(批号130401)约0.5 g，共6份，加入一定量的L-瓜氨酸对照品，按照2.3项下(2)方法制备溶液，以2.1及2.2项下条件进样5 μl进行测定，结果见表1。

表1 加样回收率实验结果 (n=6)

2.10 样品含量测定 取3批异叶天南星样品，按2.3项下方法处理，按2.5项下标准曲线计算含量。结果批号为130401、130702、140304的异叶天南星中L-瓜氨酸含量分别为(103.42±1.73)、(103.27±1.84)和(101.34±2.01) μg/g生药。

3 讨 论

氨基酸的极性很强，在普通C18色谱柱上没有色谱保留，因此本研究采用Ultimate AQ-C18色谱柱进行L-瓜氨酸的分析测定。质谱测定无需衍生化，可以通过正离子多反应监测定量离子对准确检测，并且为了提高氨基酸的色谱保留，采用了亲水极性色谱柱，与HPLC法比较，缩短了分析的时间，节省流动相，提高了分析灵敏度。本研究采用HPLC-MS法测定了异叶天南星中L-瓜氨酸的含量，所建立的检测方法简便、准确、稳定、重复性好。

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