用RP-HPLC法测定愈肠颗粒中小檗碱和异白茅苷的含量

杨帝顺，顾 清，马晓娟，章 玥，刘继勇*

(1.同济大学附属东方医院药学部，上海 200120;2.上海市闸北区中心医院药剂科，上海 200070；3.第二军医大学长海医院药学部，上海 200433)

愈肠颗粒是第二军医大学长海医院治疗急慢性结肠炎的特色院内制剂，该方选择薏苡仁、党参、白豆蔻、黄柏、红藤、乌药、羌活、乌梅、赤石脂等9味中药配伍而成，具健脾益气、涩肠止泻的功效。愈肠颗粒原有的质控方法比较落后，仅对处方中黄柏药材进行薄层色谱定性鉴别，无定量指标。因此，本研究根据处方的功效，选择黄柏药材中的小檗碱和乌梅药材中的异白茅苷(亦名异欧前胡素)等有效成分作为定量指标，采用RP-HPLC法测定愈肠颗粒中小檗碱和异白茅苷的含量，并对其方法学进行考察，以期为愈肠颗粒的质量控制和质量标准的提高提供新的依据和方法。

1 仪器和试药

1.1 仪器 SPD-10AVP高效液相色谱仪、UV-2201紫外分光光度仪(日本岛津制作所)；AG285十万分之一电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；FA-2004万分之一电子天平(上海天平仪器厂)；DL-180A超声波清洗器、DL-720A超声波清洗器(上海之信仪器有限公司)。

1.2 试剂和药品 小檗碱对照品(纯度>99.8%，批号110713-200911)；异白茅苷对照品 (纯度>99.6%，批号110827-201109，中国食品药品检定研究院)；愈肠颗粒(第二军医大学长海医院制剂室自制,批号 201211023、201211112、201211131、201212117)；甲醇、乙腈(色谱纯，美国Tedia公司)；其他试剂均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 溶液的配制 (1)对照品溶液：精密称取小檗碱对照品10 mg，异白茅苷对照品2 mg，分别置于100 ml棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀制成含小檗碱100 μg/ml、异白茅苷20 μg/ml的储备液,置于4 ℃冰箱保存。(2)样品溶液：精密称取愈肠颗粒500.6 mg置100 ml容量瓶中，加入40 ml甲醇，称定重量，超声提取15 min，用甲醇补足失重，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取滤液，即得小檗碱样品溶液。精密称取愈肠颗粒502.2 mg置100 ml容量瓶中，加50 ml甲醇，余同愈肠颗粒。过滤，取滤液，用恒温水浴锅挥尽溶剂，加入50 ml蒸馏水溶解残渣，用乙醚萃取3次,每次30 ml。合并萃取液，用氮气吹干溶剂，用甲醇复溶，移至10 ml容量瓶中用甲醇定容，溶液用0.45 μm微孔滤膜滤过，取滤液，即得异白茅苷样品溶液[1,2]。

2.2 色谱条件和系统适用性 色谱柱： Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；小檗碱流动相：乙腈-0.035 mol/L磷酸二氢钠(40∶60),异白茅苷流动相：乙腈-0.05mol/L乙酸(用三乙胺调节pH至5.0)(52∶48)；检测波长：小檗碱265 nm，异白茅苷310 nm；流速：1.0 ml/min。取上述小檗碱、异白茅苷对照品溶液和样品溶液各20 μl，按上述色谱条件分别进样，得到色谱图，见图1。由图1可见，小檗碱与异白茅苷的出峰时间分别为8.5、31.2 min。

2.3 标准曲线的制备分别精密量取小檗碱对照品储备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 ml，异白茅苷对照品储备液0.05、0.25、0.5、1、2.5、5、10 ml分别置于10 ml容量瓶中,用甲醇稀释定容，得到系列浓度为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0 μg/ml的小檗碱对照品溶液以及浓度为0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/ml的异白茅苷对照品溶液。按2.2项下色谱条件，分别精密吸取上述对照品溶液20 μl进样，测定并记录峰面积(A)。以小檗碱、异白茅苷的浓度(c)为横坐标，以相应的峰面积(A)为纵坐标，得标准曲线方程A小檗碱=80 910c+29 730,r=0.999 9 (n=7)；A异白茅苷=64 017c-1 896.2,r=0.999 9(n=7)。结果表明，小檗碱、异白茅苷分别在1.0～60.0 μg/ml、0.1～20.0 μg/ml范围内线性关系良好。

图1 小檗碱和异白茅苷的HPLC谱图

2.4 精密度实验 分别取低、中、高3种浓度(小檗碱1.0、10.0、60.0 μg/ml；异白茅苷5.0、10.0、20.0 μg/ml)的对照品溶液，按2.2项下色谱条件测定，两次进样间隔4 h，连续测定3 d，记录峰面积，计算得低、中、高浓度小檗碱的日内RSD分别为1.31%、1.97%和0.7%(n=3)，异白茅苷的日内RSD分别为0.59%、0.48%和1.31%(n=3)。低、中、高浓度小檗碱的日间RSD分别为1.66%、0.84%和0.38%(n=3)；异白茅苷的日间RSD分别为0.26%、0.34%和0.36%(n=3)。

2.5 稳定性实验 取同一批(批号 201211023)的样品溶液，按2.2项下色谱条件分别于0、2、4、6、8、10 h测定其峰面积，计算相应的RSD，小檗碱的RSD为1.58%,异白茅苷的RSD为0.74%。表明样品溶液在配制后10 h内稳定。

2.6 重复性实验 取小檗碱浓度为10.0 μg/ml，异白茅苷浓度为10.0 μg/ml的对照品溶液，按2.2项下色谱条件连续进样6次，记录其峰面积，并计算RSD。小檗碱的RSD为1.42%(n=6)，异白茅苷的RSD为0.80%(n=6)，表明该方法的重复性良好。

2.7 回收率实验 精密量取3份2.1(2)项下样品溶液各2 ml分别置于10 ml容量瓶中，再分别精密加入5 μg/ml的小檗碱对照品溶液1、2、5 ml；分别加入2 μg/ml的异白茅苷对照品溶液0.5、1、2 ml于相应的容量瓶中，用甲醇定容，配成低、中、高3种不同浓度的加样待测样品溶液，按照2.2项下色谱条件进样测定，计算得到低、中、高浓度小檗碱和异白茅苷的回收率。结果见表1。

表1 加样回收率的测定结果

2.8 样品含量测定 取批号为201211112、201211131、201212117的3批愈肠颗粒，按照2.1(2)项下方法制备样品溶液，按照2.2项下色谱条件进样测定，计算得到愈肠颗粒中小檗碱、异白茅苷的含量。结果见表2。

表2 愈肠颗粒中小檗碱和异白茅苷的含量测定结果

3 讨 论

愈肠颗粒原质控标准采用薄层色谱法定性鉴别，无定量指标。因此选取其中有效成分小檗碱、异白茅苷作为考察指标，测定愈肠颗粒中小檗碱、异白茅苷的含量。取小檗碱和异白茅苷对照品溶液，用紫外分光光度仪进行全波长扫描,小檗碱和异白茅苷分别在265、350、365 nm和250、309、310 nm处有较大吸收。根据文献[3-6]及预实验，选择265和310 nm分别作为小檗碱和异白茅苷的检测波长。对流动相为甲醇-水系统、甲醇-0.06%磷酸水溶液系统、甲醇-0.05 mol/L冰乙酸系统、乙腈-0.1%磷酸水溶液系统、乙腈-0.05 mol/L冰乙酸系统及乙腈-水等系统进行了比较。经过检测，小檗碱和异白茅苷的最大吸收峰出现时间不同，并且两者的极性相差较大，在同一流动相中要用较长时间才能分离，不便于生产和实验室检测。因此，选择乙腈-0.05 mol/L乙酸(用三乙胺调节pH至5.0)(52∶48)系统、乙腈-0.035 mol/L的磷酸二氢钠水溶液(40∶60)系统分别作为流动相检测异白茅苷和小檗碱[7,8]。考察样品的提取方法和提取溶剂时选择甲醇作为溶剂，超声提取。异白茅苷在样品中含量较低，不易直接超声提取，因此在超声提取的基础上蒸干溶剂再二次溶解萃取。实验结果表明，在所采用的色谱条件下，甲醇作为提取溶剂并以超声提取的方法，样品分离完全、峰形较好，且操作简便。

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