金猫解毒颗粒中丹参素钠的含量测定

章一菡，宋洪杰，蔡 溱，卞艳芳，辛海量

(1.第二军医大学长海医院药学部，上海 200433；2.第二军医大学长海医院中医科，上海 200433；3.第二军医大学中医系，上海 200433)

肝癌、食管癌、肠癌和肺癌等肿瘤属中医“癌病”、“积证”、“癥瘕”等范畴，气滞、血瘀、痰凝、湿浊、癌毒等病理变化是肿瘤发生发展的原因所在，其基本病机为毒瘀搏结，故解毒抗癌、活血散结为临床主要治法之一。第二军医大学长海医院中医科临床用于恶性肿瘤防治的解毒方由猫人参、石见穿、山慈菇和鸡内金4味中药组成。近10年来，已对解毒方做过较多基础和临床研究，证明其可以缩小肿瘤体积，延长病人生存期[1]。该方猫人参中皂苷类成分对肝癌、肺癌等多种肿瘤细胞株均有明显抑制作用[2]。石见穿系唇形科植物华鼠尾草的地上部分，曾收载于《中华人民共和国药典》(1997年版)，具有清热解毒、活血止痛的功效，用于急慢性肝炎[3]、肾炎、风湿骨痛、癌症，面神经麻痹、白带异常、痛经等症。前期作者研制了金猫解毒颗粒非标制剂，现对本品中石见穿有效成分丹参素钠的含量进行分析，对制剂进行质量控制。

1 仪器和试药

1.1 仪器 LC-20AD高效液相色谱仪、AUW220D十万分之一电子分析天平(日本岛津公司)；DL-720超声波自动清洗器(上海之信仪器有限公司)；SHB-Ⅲ循环水式真空泵(南京予凯仪器有限公司)；Diamonsil C18色谱柱、EasyGuard C18保护柱(美国Dikma公司)。

1.2 试剂和药品 丹参素钠对照品(纯度>98%，批号121103，上海融禾医药科技有限公司)；甲醇(色谱纯，批号6508AZ02，美国Dikma公司)；冰乙酸(分析纯，批号20120530)、磷酸(分析纯，批号T20080530，国药集团化学试剂有限公司)；高纯水、金猫解毒颗粒(批号110320、110321、110322，第二军医大学中医系自制)。

2 方法和结果

2.1 溶液的配制 (1)对照品储备液 精密称取丹参素钠对照品10.28 mg，置10 ml容量瓶中，以高纯水溶解，定容，即得浓度为1.028 mg/ml的对照品储备液，置4 ℃冰箱保存待用。(2)供试品溶液 取金猫解毒颗粒约0.5 g，精密称定，置10 ml具塞试管中，精密加入10 ml高纯水，密封，称重，25 ℃超声处理(功率600 W，频率60 kHz)1 h，放冷，以高纯水补足减失的重量，摇匀，用0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2 色谱条件和系统适用性实验 色谱柱：Diamonsil C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，保护柱：EasyGuard C18柱(10 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.5%冰乙酸 (10∶ 90)；柱温：26 ℃；检测波长：280 nm；流速：1.0 ml/min。理论塔板数按丹参素钠峰计算不<5000，丹参素钠的保留时间为13.72 min,与相邻色谱峰分离度>1.5，色谱峰拖尾因子在0.95～1.05，色谱图见图1。

图1 丹参素钠的HPLC谱图

2.3 线性关系的考察 精密吸取丹参素钠对照品储备液适量，用高纯水稀释成浓度分别为514.0、411.2、308.4、205.6、102.8、51.4 μg/ml的系列溶液，取10 μl 注入HPLC仪，按2.2项下色谱条件测定，以峰面积(A)对浓度(c)进行线性回归，得标准曲线方程：A=5 529.6c+12 917，r=0.999 0(n=6)，线性范围：51.4～514.0 μg/ml。

2.4 精密度实验 精密吸取浓度为205.6 μg/ml的丹参素钠对照品溶液10 μl，注入HPLC仪，重复进样6次，结果平均峰面积的RSD为0.3%(n=6)，表明精密度良好。

2.5 稳定性实验 精密吸取10 μl供试品溶液,分别于0、3、6、9、12、24 h注入HPLC仪测定，结果平均峰面积的RSD为2.02%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.6 重复性实验 按2.1项下(2)方法制备供试品(批号110320)溶液，共6份，取10 μl 注入HPLC仪测定，计算丹参素钠的含量。结果平均含量的RSD为1.53%(n=6)，表明重现性良好。

2.7 加样回收率实验 准确称取同一批样品(批号110320)9份，置10 ml容量瓶中，加入1.02 mg/ml的丹参素钠对照品溶液适量，用高纯水定容至刻度，样品处理和测定方法同前。结果平均加样回收率为(99.27±2.80)%，RSD为2.80%(n=9),表明该方法回收率良好。

2.8 样品含量测定 按2.1项下(2)方法制备供试品溶液，取10 μl注入HPLC仪，计算3个批次金猫解毒颗粒中丹参

素钠的含量，结果批号为110320、110321、110322的金猫解毒颗粒中丹参素钠的含量分别为(3.00±0.12)、(3.04±0.16)、(3.12±0.18) mg/g，RSD分别为4.02%、5.34%和5.77%(n=3)。

3 讨 论

由于金猫解毒颗粒中猫人参、山慈菇和鸡内金的活性成分尚未明确，故选择了臣药石见穿中有活血祛瘀作用的活性成分丹参素钠作为含量测定的指标。

本研究对色谱条件进行了考察，包括比较甲醇-0.1%磷酸 (10∶90)、甲醇-0.5%冰乙酸(10∶90)、甲醇-1%冰乙酸(10∶90)、甲醇-1%冰乙酸(8∶92)等流动相系统[4-6]。结果发现以甲醇-0.5%冰乙酸(10∶90)溶液为流动相，丹参素钠与其他色谱峰可以达到基线分离，峰形良好，在51.4～514.0 μg/ml范围内呈良好的线性关系，方法精密度高、重复性好，满足金猫解毒颗粒中丹参素钠定量分析要求。

测定结果表明，3批金猫解毒颗粒中丹参素钠含量均>3.0 mg/g，同时考虑到石见穿药材质量差异较大，暂将本品中的丹参素钠含量限度定为不得<2.0 mg/g，待大生产中积累数据，再进行修订。

【参考文献】

[1] Zhai XiaoFeng, Chen Zhe, Li Bai,etal.Traditional herbal medicine in preventing recurrence after resection of small hepatocellular carcinoma: a multicenter randomized controlled trial[J]. J Integr Med,2013,11(2): 90-100.

[2] 叶 春.猫人参的研究概述与利用[J].中国药业，2011,20(6):68.

Ye Chun.An overview on research and application of the roots ofActinidiavalvata[J].China Pharmaceuticals, 2011,20(6):68.In Chinese.

[3] 郑海音，武一曼，林信富，等.流式细胞术检测石见穿多糖诱导的肝癌细胞凋亡率[J].福建中医学院学报，2009,19(3)：20-21.

Zheng HaiYin,Wu YiMan,Lin XinFu,etal.Detection of apoptosis of hepatoma cells induced bySalviachinensisBenth. polysaccharides with flow cytometry[J].J Fujian Univ Tradit Chin Med,2009,19(3)：20-21.In Chinese with English abstract.

[4] 解世全，王 巍，赵焕君.HPLC测定丹黄祛瘀胶囊中丹参素钠的含量[J].广州化工，2012,40(15):157-158.

Xie ShiQuan,Wang Wei,Zhao HuanJun.Determination of sodium Danshensu in Danhuang Quyu capsules by HPLC[J].Guangzhou Chem Ind,2012,40(15):157-158.In Chinese with English abstract.

[5] 章金凤，李佳林，张丽华.HPLC法测定三味益肝颗粒中丹参素钠的含量[J].中国民族医药杂志，2012，(1):64-66.

Zhang JinFeng,Li JiaLin,Zhang LiHua.Determination of sodium Danshensu in Sanweiyigan granules by HPLC method[J].J Med Pharm Chin Minorities,2012,(1):64-66.In Chinese with English abstract.

[6] 李艳丽，张 虹，陈湘玲，等.高效液相色谱法测定止眩通脉胶囊中丹参素钠的含量[J].山西医科大学学报，2012,43(11):832-834.

Li YanLi,Zhang Hong,Chen XiangLing,etal.Determination of contents of sodium Danshensu in Zhixuantongmai capsules by HPLC[J].J Shanxi Med Univ,2012,43(11):832-834.In Chinese with English abstract.