LC-MS-MS法测定人血浆中非布司他浓度

姜 楠，杨永革，宋丽雪，许雪廷 (北京军区总医院药理科，北京 100700)

非布司他 (febuxostat，FEB) 是新型的非嘌类黄嘌呤氧化酶选择性抑制剂[1]，临床上用于预防和治疗高尿酸血症及引发的痛风。其化学名称为(3-氰基-4-异丁氧基苯基) -4-甲基 -5-唑甲酸，是美国 FDA于 2009 年 2 月 13 日批准的用于治疗尿酸过高症的药物，至今国内仍未上市。到目前为止，关于非布司他的研究报道较少。为了更清楚了解非布司他的药学特点，本研究建立了简单、灵敏的LC-MS-MS检测人血浆非布司他浓度的方法，适用于非布司他人体药代动力学和生物等效性研究。

1 仪器与试剂

1.1仪器 质谱仪：Thermo Finnigan TSQ Quantum型液相色谱-三重四极杆质谱联用仪，配有电喷雾离子化源(ESI源)；Agilent 1100高效液相色谱系统： G1313A自动进样器；G1312A二元梯度泵；在线脱气机、柱温箱(美国Agilent公司)、分析柱为Thermo Biobasic-8柱(5 μm,50 mm×2.1 mm)；FinniganXcalibur 色谱/质谱数据系统。Sigma1-14型高速离心机(美国Sigma公司)；XW-80A微型涡旋混合仪(上海沪西分析仪器有限公司)；Ohaus Discovery型电子分析天平(奥豪斯国际贸易有限公司)。

1.2试剂 非布司他对照品(南京海辰药业有限公司，纯度99.5%，批号：20100401)，内标苯扎贝特对照品(中国药品生物制品检定所，批号：100732-200501)。乙腈、甲醇为色谱纯(均为Merck公司)；乙酸胺、甲酸为分析纯，水为重蒸去离子水。

2 方法与结果

2.1试验条件

2.1.1色谱条件 色谱柱：Thermo Biobasic-8柱(5 μm,50 mm×2.1 mm),流动相：乙腈-10 mmol/L乙酸铵(含0.05%甲酸)(70:30)，流速：0.2 ml/min；柱温：室温。

2.1.2质谱条件 电喷雾离子化电离源ESI负离子检测，喷雾电压(SP)3 500 kV，鞘气(SGP)流速10 Arb，辅助气(AGP)流速45 Arb，毛细管温度(TEM 270 ℃；非布司他和内标苯扎贝特的碰撞能量分别为10、18 eV；选择反应监测(SRM)分别测定非布司他和内标苯扎贝特负离子m/z315→271和m/z360→274；扫描时间为0.5 s。

2.2血浆样本的预处理 精密量取血浆样品100 μl，置1.5 ml具塞小塑料管中，加10 μl内标溶液(苯扎贝特，50 μg/ml)混匀，再加300 μl 乙腈→在微型混合器上涡流振荡2 min(沉淀蛋白)→离心(10 000 r/min)10 min分层，取上清夜100 μl放入进样瓶中，10 μl进样检测。

2.3方法的专属性 按选定的LC-MS-MS条件测试6名健康人的空白血浆、空白血浆+非布司他标准样品+内标、受试者口服非布司他片后的血浆样品，来对特异性进行考察。由图1可见非布司他与苯扎贝特分别在1.14和1.00 min出峰(图中从左至右分别为总离子流图、非布司他、苯扎贝特)，非布司他与苯扎贝特峰形良好，无杂质峰干扰测定，专属性好。

图1 血浆中非布司他选择反应监测(SRM)色谱图

2.4线性范围和定量限 精称10.05 mg非布司他对照品(相当于非布司他10 mg)、10 mg苯扎贝特标准品，分别溶于10 ml甲醇成1 g/L的标准品溶液，分装后-70 ℃储存待用。用1 g/L非布司他标准品溶液配成一系列浓度的工作溶液，分别取各浓度工作溶液10μl于90μl空白血浆中，使非布司他的血浆终浓度分别为10、30、100、300、1 000、3 000、6 000、8 000 μg/L，余同血浆样品处理和测定。将不同浓度系列标准样品测得的非布司他与内标峰面积比值为纵坐标，非布司他浓度为横坐标，直线加权回归。得到线性回归方程Y=0.003 094+0.000 756X，r>0.99。方法的最低检测浓度为10 μg/L。

2.5精密度与回收率 按非布司他标准曲线制备方法制备质控样品，对30、1 000、7 000 μg/L 3种浓度进行了连续3 d的6个样本分析，以评价方法的日内、日间精密度。以空白血浆乙腈沉淀提取液，加入非布司他与内标的标准溶液配制低、中、高3种浓度(30、1 000、7 000 μg/L)的标准品样本，计算回收率。以流动相代替空白血浆，同样方法配制低、中、高3种浓度(30、1 000、7 000 μg/L)的标准品样本，计算基质效应。方法学考察结果见表1。

表1 方法学考察结果

2.6稳定性试验 对室温放置2 h、-70℃保存30 d、-70℃-室温反复冻融3次的血浆样品稳定性进行考察，低、中、高3个浓度变异均小于15%，符合指导原则要求；血浆样本经2.2项下预处理后室温放置8 h可保持稳定。

3 讨论

非布司他是美国 FDA于 2009 年批准的用于治疗尿酸过高症的药物，至今国内仍未上市。国内发表的非布司他血药浓度检测的文献较少[2，3]。为了更清楚地了解非布司他在中国人体内的药学特点，笔者建立了简单、灵敏的LC-MS-MS检测方法，并用于临床生物样本的大批量检测。

本方法采用恒比流动相质谱检测法，比荧光梯度检测法[2]快捷灵敏；并通过优化色谱条件，选择了Thermo Biobasic-8柱(5 μm,50 mm×2.1 mm)，使单个样品检测仅需要2 min，比文献[3]大大减少了检测时间与环境污染；采用乙腈沉淀法，使血浆样品处理非常简便快捷。

本方法检测专属性强，灵敏度高，简便快捷，适于临床生物样本的大批量检测，对非布司他生物等效性与药代动力学研究有很好的参考价值。

【参考文献】

[1] Mayer MD, Khosravan R, Vernillet L,etal. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of febuxostal, a new non-purine selective inhibitor of xanthine oxidase, in subjects with renal impairment[J]. Am J Ther, 2005，12(1):22-34.

[2] 张文丽，程 航，阳国平.高效液相-荧光法测定人血浆中非布司他的浓度及其人体药动学研究[J].临床药理学，2011，16(10):1148-1152.

[3] 施 政，刘 健，申屠建中，等. 非布司他在中国健康人体的生物等效性[J].中国临床药理学杂志，2013，162(4)：276-279.