组氨酸标签木聚糖酶的构建表达和酶特性鉴定

熊海容, 陈 丰，王亚伟, 张 巍

(中南民族大学 生命科学学院，武汉 430074)

木聚糖是生物界中含量最高的半纤维素物质，约占细胞干重的35%.木聚糖内切酶(Endoxylanases, EC 3.2.1.8)特异水解木聚糖中β-1,4糖苷键，是一种重要的工业酶，在食品、饲料、纺织、造纸等行业有重要应用[1-3].在饲料中添加木聚糖酶能很好地消除木聚糖的抗营养作用[4,5].木聚糖酶在工业上的应用受到高温、极端pH下低活性低稳定性的限制，故获得具有良好酶特性，适于工业生产用木聚糖酶成为研究热点.

嗜热真菌(Thermomyceslanuginosus)能产生耐热的酶，尤其是糖苷水解酶11家族的木聚糖酶.嗜热真菌T.lanuginosusDSM 10635分离自捷克土壤，产生的木聚糖酶最适温度为70℃，最适pH值为6.5，分子量为21.30 kDa[1].Yawei Wang等[2, 6]将其表达于大肠杆菌系统，并进行了双硫键突变，获得耐热木聚糖酶突变体DSB，最适反应条件为75℃，pH 6.5.

耐热木聚糖酶粗酶液经硫酸铵沉淀后依次经过疏水层析(HIC)和离子交换层析(DEAE Sepharose FF)得到纯化蛋白[1].因蛋白质组学和结构基因组学研究需要大量的高纯蛋白，通过组氨酸标签标记，固定化金属亲和层析可达到理想的纯化效果[7].组氨酸标签只有6个氨基酸，在蛋白质外侧形成不规则卷曲，但与金属离子络合效果理想，在蛋白纯化、固定化酶等领域应用广泛.组氨酸标签对蛋白质几乎不产生影响，只需一步纯化操作，且纯化后可不用去除标签[8, 9]，相比于两步法纯化操作简便纯化效果提高显著.但有相关文献报道添加组氨酸标签可能对蛋白质性质产生影响[10,11].故构建组氨酸标签融合蛋白后需测定组氨酸标签对蛋白特性产生的影响.

本文通过分子生物学方法构建重组质粒，将其转化到表达宿主BL21(DE3)，诱导表达获得碳端含有His-tag的重组酶DSB.细胞培养液离心后得到的上清液依次经过硫酸铵浓度梯度沉淀和Ni Sepharose层析分离，获得电泳纯的重组酶DSB，为快速纯化和研究其蛋白结构、酶学性质打下基础.

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

耐热木聚糖酶基因dsb由本实验室构建并保存[2].克隆载体pMDTM18-T Vector(宝生物工程公司)，表达载体pET-22b(+) (Ampr) 、大肠杆菌Escherichiacoli. DH5α和BL21均由本实验室保存.质粒小提试剂盒和DNA回收试剂盒(Axygen公司)，PCR Mix酶(东盛生物有限公司)，限制性内切酶NcoI、XhoI、T4 DNA ligase (宝生物工程有限公司).引物(金斯瑞生物科技公司)，桦木木聚糖(Sigma公司).其他试剂均为国药分析纯.赛多利斯膜包(Sartorius Vivaflow 50)，大肠杆菌培养基LB：酵母膏0.5 g/L，蛋白胨1.0 g/L，氯化钠1.0 g/L.

超滤管(Millipore 3000 NMWL)，PCR仪(BIO-RAD, USA)，立式高速冷冻离心机(BACKMAM, USA)，台式高速冷冻离心机(Eppendorf, Ger)，凝胶成像系统，SW-CJ-2FD超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司, 江苏苏州)，HH-4恒温水浴锅(金坛市科兴仪器厂, 江苏常州)，HD-4电脑核酸蛋白检测仪(上海沪西分析仪器有限公司, 上海)，TCL-16G-B离心机(湖南星科科学仪器有限公司, 湖南长沙).

1.2 组氨酸标签的添加

参考文献[6, 9, 10, 12, 14]，以重组质粒pET-22b(+)-dsb为模板，设计引物如下：上游引物mF2：5’-GCTCCCATGGATTGCGGAACCCCCAACTCGGAGGGCT-3’；下游引物hR ： 5’-GGACCTCGAGTTCGCCCACGTCAGCAACGGTGATGCG-3’.上、下游引物各带有NcoI、XhoI酶切位点.以dsb为模板进行PCR反应.反应体系(50 μL)含25 μL PCR Mix酶，上、下游引物(mF2、hR)各1 μL(100 μM)，模板1 μL(250 ng/μL).PCR程序：95℃ 5 min；30 cycles：95℃ 30 sec，62℃ 30 sec，72℃ 1 min；72℃ 10 min.产物用1.0%琼脂糖凝胶检验并回收.

1.3 表达菌株的构建

图1 重组质粒构建示意图Fig.1 The schematic diagram for the construction of recombinant plasmid

表达菌株的构建如图1所示.将PCR产物与pMDTM18-T Vector连接，热激法将连接产物转化入感受态细胞DH5α进行克隆.PCR检验阳性重组子.用NcoI、XhoI消化目的片段和pET-22b(+)，琼脂糖凝胶电泳回收后用T4连接酶连接，转入感受细胞BL21(DE3)，筛选出阳性转化子进行培养，IPTG诱导表达.选取酶活最高的菌株送测序.测序结果与dsb进行序列比对，结果正确的即为构建的目标工程菌，构建的基因命名为dsb-his[6, 12, 13, 14].

1.4 重组蛋白的表达

参考文献[13,15]，将筛选出来的阳性重组子挑取单菌落接入20 mL的LB(Amp+)摇瓶中，摇床培养12 h(37℃，220 r/min).将种子液以2%(v/v)的接种量接入2.0 L的LB(Amp+)发酵罐中，37℃恒温培养.12 h后加入终浓度为0.1 mmol的IPTG诱导.诱导72 h后停止诱导.发酵液12000 r/min离心25 min，保留上清液.

1.5 重组木聚糖酶的纯化

参考文献[8,15,16]，将发酵上清液用微滤装置进行抽滤，滤液用赛多利斯膜包浓缩至130 mL.加入终浓度为70%的硫酸铵晶体后离心(12000 r/min, 20 min)，沉淀用20 mL磷酸-柠檬酸缓冲液(pH 6.5)溶解.溶解的粗酶液用微滤装置除去杂质后，进行镍亲和层析纯化.

将制备好的层析柱连接到蛋白监测系统，用Binding Buffer(20 mM PBS、500 mM咪唑)在位清洗Ni-NTAresin预装柱至蛋白检测仪显示平稳后，将流动相改为不含咪唑的20 mM PBS(pH 7.2～7.4)缓冲液作流动相1 mL/min清洗至检测器示数稳定.上样，上样量在2倍柱体积以内，上样后用20 mM PBS洗至检测仪平稳.用不同咪唑含量的PBS(20 mM)洗脱镍亲和层析柱上的蛋白，通过蛋白检测装置检测流出液在280 nm处吸光度变化，收集最高洗脱峰流出液.收集的酶液用超滤管浓缩至5 mL，得纯化的酶液.

1.6 重组木聚糖酶特性测定

参考文献[5, 6]，用SDS-PAGE分析纯化酶液.采用 DNS 定糖法测定木聚糖酶DSB-His的活性.酶活定义为：75℃，pH 6.5条件下，以桦木木聚糖为底物，每分钟产生1 μmol木糖所需的酶量为一个酶活力单位(1 IU).产物以D-木糖作为标准.反应体系为1.8 mL 0.5%预热的底物中加入0.2 mL酶液，准确反应10 min后加入3.0 mL DNS混匀，沸水中准确反应5 min，冷却后在540 nm处测其吸光度.不同pH缓冲液(50 mM)使用范围：pH 4.0～7.5为磷酸-柠檬酸缓冲液，pH 7.5～9.0为Tris-HCl缓冲液，pH 9.0～10.0为甘氨酸-NaOH缓冲液.

2 实验结果

2.1 菌种构建电泳图

以dsb基因为模板，以mF2、hR为引物进行PCR扩增，结果如图2所示，电泳得到1条约600 bp条带.

1) PCR产物; M) DNA marker 图2 PCR产物凝胶电泳结果Fig.2 Gel electrophoresis results of PCR production

目的基因与表达载体双酶切电泳检测结果如图3. 泳道1未经过双酶切的环状pET-22b(+)，大小为5493 bp，与经过酶切的线性载体形成对照；泳道2为经过双酶切的pET-22b(+)；泳道M1为DNA Marker，条带大小同图2中泳道1；泳道4为为酶切的目的片段，大小为600 bp，T载体大小约2700 bp；泳道M2为DNA Marker.

1)未经酶切的载体; 2)经双酶切的pET-22b(+); M1) DNA Marker; 4) 双酶切目的片段; M2) DNA Marker图3 dsb-his与pET-22b(+)双酶切电泳检测图Fig.3 The electrophoresis detection results of the double enzyme of dsb-his and pET-22b(+)

目的基因与pET-22b(+)载体连接后转化大肠杆菌BL21，PCR检测转化菌株，引物及程序同突变PCR操作相同.PCR结果如图4所示，得到600 bp片段的菌株为阳性菌株，扩大培养并保藏.

1～3) PCR产物; M) DNA Marker 2000图4 PCR扩增产物电泳图Fig.4 Electrophoresis identification of PCR product

2.2 重组蛋白的纯化结果

重组蛋白经Ni亲和层析，梯度浓度咪唑冲洗层析柱，蛋白检测仪检测280 nm处吸光度图谱，结果见图5.图5中a为上样峰，上样后用PBS(0.02M)冲洗柱子产生，主要成分为未与柱子结合的蛋白.b,c,d,e分别为含10, 50, 100, 500 mM咪唑的PBS缓冲液洗出峰.收集各组洗出峰，与木聚糖反应检测酶活，结果50 mM咪唑洗出峰具有较高的木聚糖酶酶活，c～e洗出峰检测几乎没有木聚糖酶酶活，说明50 mM咪唑洗出DSB效果最好.

a) 上样峰；b～e) 10, 50, 100, 500 mM咪唑洗出峰图5 Ni凝胶亲和层析图谱Fig.5 Ni agarose affinity chromatography fingerprint

纯化蛋白经SDS-PAGE分析得到单一条带(见图6)，大小为约23 kDa，说明DSB-His经过Ni亲和层析得到电泳纯蛋白，一步纯化即可得到电泳纯蛋白.

M) 标准分子质量; 1) 经Ni柱纯化的DSB-His蛋白样品图6 纯化DSB SDS-PAGE电泳图Fig.6 The SDS-PAGE of purified DSB

2.3 重组蛋白酶特性测定结果

在pH5.0下测定酶的最适温度，反应在不同温度下进行，反应均为1.8 mL预热的底物中加入0.2 mL用缓冲液稀释的酶溶液，准确反应10 min，加入3.0 mL DNS终止反应，混匀后沸水浴5 min，在540 nm处测定吸光度.以最高吸光度为100%，计算其他条件下的相对残余酶活，结果见图7a.由图7a可见，最适反应温度为75℃，在60～80℃范围内保持有较高的酶活，高于80℃时酶活迅速降低.

酶的耐热性在pH 5.0和6.5两个环境中测定.将用缓冲液稀释的酶液在不同温度水浴保温30 min，迅速取出置于冰上，在最适温度和pH条件下完成反应，测定结果见图7b.由图7b可见，酶具有较高的热稳定性.在70℃下保温30 min，在pH 6.5条件下残余80%以上的酶活力，在pH 5.0条件下残余60%以上酶活力.

不同pH环境下反应测定最适pH，结果见图7c.图7c中显示DSB-His具有较宽的pH活力范围，从pH 5.0～9.0均有较高酶活.最适反应pH值为6.5.

用不同pH缓冲液稀释酶液保温30 min后在最适温度，最适pH条件下反应测定酶的pH耐受力，结果见图7d.图7d中在0℃保温的酶几乎不受pH变化影响，酶活力几乎无损失.在70℃条件保温的酶溶液具有很宽的稳定范围，从pH 5.0～10.0均具有较高的酶活力.

a)DSB-His木聚糖酶最适温度；b)DSB-His木聚糖酶热稳定性；c)DSB-His木聚糖酶最适pH；d)DSB-His木聚糖酶pH稳定性图7 DSB-His酶学特性Fig.7 Enzyme characterization of DSB-His

3 讨论

不同来源的11家族的木聚糖酶的三维晶体结构非常相似，典型11家族木聚糖酶的二级结构主要由β片层加上一个α螺旋构成.这些β片层构成一个类似右手的三维结构，包括拇指区，手掌区，手指区[5].N端结构主要为β折叠片，保持蛋白结构，对酶的活性和稳定性影响较大.而C端对蛋白的结构和活性影响很小，故选用蛋白C端连接His-tag.

本文采用大肠杆菌表达系统中常用的E.coliBL21(DE3)，该宿主是以 T7 RNA 聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主.pET系列载体是目前最有效的大肠杆菌表达载体，它是利用大肠杆菌T7噬菌体的转录体系为元件构建的高效表达载体.本文采用pET-22b(+)来表达目的蛋白酶，载体携带的N-terminal pelB 信号肽可将酶携带排出细胞外，降低了大肠杆菌表达系统的过载和形成包涵体的机会，提高了外源蛋白的活性.

构建菌株经诱导产酶，粗酶液浓缩后利用Ni Sepharose层析纯化，可得到电泳纯的酶.添加了组氨酸标签的木聚糖酶的酶特性显示，获得DSB-His最适温度为75℃，最适pH值为6.5，在pH 6.5，70℃处理30 min，酶活力仍保留80%以上残余.酶蛋白在广泛的pH 5～10具有良好的稳定性，pH 10.0，70℃处理30 min，残余酶活力保留60%以上.与突变前[2]相比，其酶学特性未受到组氨酸标签影响，说明组氨酸标签较为短小，在重组蛋白外侧成无规则卷曲，不影响重组蛋白与底物的结合、催化，不必要对组氨酸标签进行切除.此木聚糖酶纯化方式简单易行，且蛋白纯度高，便于相关木聚糖酶的结构和性质研究.

参 考 文 献

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