二氢睾酮对小鼠角膜上皮细胞Mucins表达的影响△

黎黎 高鸽 郑璇 王双梅 康前雁

二氢睾酮对小鼠角膜上皮细胞Mucins表达的影响△

黎黎 高鸽 郑璇 王双梅 康前雁

雄激素；二氢睾酮；黏蛋白；角膜上皮细胞

目的探讨不同浓度二氢睾酮(DHT)对角膜上皮黏蛋白Mucins表达的影响。方法体外原代培养BALB/c小鼠角膜上皮细胞，分为空白对照组以及DHT干预组，DHT干预组给予不同浓度(0.05 g·L-1、0.10 g·L-1、0.20 g·L-1、0.50 g·L-1、1.00 g·L-1)DHT干预24 h；采用RT-PCR方法与免疫荧光组织化学方法分别检测Muc1、Muc4 mRNA以及蛋白水平的表达。结果Muc1、Muc4 mRNA检测结果显示：空白对照组，0.05 g·L-1、0.10 g·L-1、0.20 g·L-1、0.50 g·L-1DHT干预组Muc1 mRNA相对表达量分别为1.00±0.00、0.15±0.01、1.40±0.09、0.07±0.11、0.06±0.02；Muc4 mRNA相对表达量分别为1.00±0.00、0.30±0.28、1.36±0.05、0.43±0.01、0.45±0.01，0.10 g·L-1DHT干预组Muc1、Muc4 mRNA表达水平较空白对照组明显增加，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；0.05 g·L-1、0.20 g·L-1、0.50 g·L-1DHT干预组表达均下降，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。免疫荧光化学检测结果示，以上各组Muc1 OD值分别为1.86±0.01、1.82±0.01、2.03±0.04、1.88±0.01、1.81±0.02，0.10 g·L-1DHT干预组Muc1表达较空白对照组明显增加，0.05 g·L-1、0.50 g·L-1DHT干预组表达均下调，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；Muc4 OD值分别为1.86±0.00、1.77±0.01、1.84±0.02、1.92±0.00、1.69±0.05，0.10 g·L-1与0.20 g·L-1DHT干预组Muc4表达较空白对照组明显增加，0.05 g·L-1、0.20 g·L-1、0.50 g·L-1DHT干预组表达均下调，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。0.50 g·L-1与 1.00 g·L-1DHT可影响细胞体外生长。结论一定浓度DHT(如0.10 g·L-1)可上调小鼠角膜上皮细胞Muc1与Muc4的表达水平；而高浓度(0.50 g·L-1与 1.00 g·L-1)DHT对角膜上皮细胞存在毒性作用。

[眼科新进展，2014，34(8)：701-704，709]

干眼是一类因泪液质或量异常，导致泪膜不稳定，伴眼部不适，严重时导致眼表组织结构病变的眼科疾病。干眼的发病由多种因素参与，近年研究发现性激素分泌失衡也参与干眼的发生和发展[1-2]。实验证实在眼表的泪腺、睑板腺、结膜和角膜细胞中均有雄激素受体的表达[3]，并且雄激素水平的改变可以调控睑板腺、泪腺功能，进而影响泪膜的稳定性，参与干眼的发生与发展。已有研究发现雄激素水平降低会减少眼表结膜杯状细胞的数量，使其分泌的黏蛋白缺乏，导致泪膜稳定性降低[4]。但目前对雄激素调控黏蛋白表达的研究较少，尤其是雄激素对角膜上皮细胞膜结合型黏蛋白的研究更为少见，已证实在其他组织中雄激素与黏蛋白基因的表达密切相关[4]，并影响疾病的进程，推测同样对眼表疾病的发生发展有类似影响。本实验以小鼠角膜上皮细胞为研究对象，研究不同浓度二氢睾酮(DHT)对角膜上皮细胞中的膜结合型黏蛋白Mucin1(Muc1)与Mucin4(Muc4)表达的影响。

1 材料与方法

1.1材料健康清洁级4～6周BALB/c小鼠，体质量12～16 g(西安交通大学医学院动物中心提供)。所用培养液采用DMEM/F12(11)，加入体积分数10%胎牛血清、20 μg·L-1重组人表皮生长因子、50 U·mL-1青-链霉素。兔抗鼠多克隆抗体CK3(北京博奥森生物技术有限公司)；Muc1兔抗鼠多克隆抗体(ab15481，美国Abcam公司)；Muc4兔抗鼠多克隆抗体(sc-20117，英国Santa公司)；Trizol Reagent (美国Gibco公司)；反转录、Real-time PCR试剂盒(大连宝生物制品公司)。

1.2方法

1.2.1角膜上皮细胞体外培养及分组(1)取材：以颈椎脱臼法处死小鼠，无菌条件下摘除眼球，并置于D-Hank液(含300 mg·L-1青-链霉素)中漂洗2遍，显微镜下分离角膜组织待用。(2)组织块贴壁法原代培养角膜上皮细胞：35 mm培养皿均匀种植10个1 mm×2 mm角膜组织块，上皮面朝上，加入培养液，以后每2～3 d换液一次。待细胞融合至80%时去除组织块，可传代或进行下一步实验。细胞生长融合后随机分为空白对照组(只加入培养基，无DHT干预)以及DHT干预组(给予不同浓度0.05 g·L-1、0.10 g·L-1、0.20 g·L-1、0.50 g·L-1、1.00 g·L-1DHT孵育24 h)。细胞培养期间每天倒置显微镜下观察细胞的生长状态，并照相记录。(3)角膜上皮细胞爬片培养：按照组织块培养法将细胞接种在处理好的爬片上，40 g·L-1多聚甲醛固定，用于进行免疫荧光化学染色。所有实验均重复3次。

1.2.2实时荧光定量PCR检测Muc1、Muc4mRNA的表达Trizol Reagent提取细胞总RNA，测总RNA浓度及波长260 nm与280 nm处光密度(OD)值的比值(OD260/OD280)，-70 ℃保存备用。引物设计：在Genbank中查出Mucin基因和内对照基因(β-actin)的cDNA序列，用软件Primer 6.0设计引物。Muc1引物序列：上游：5’-CCAGGACACCTACCATCCTATGAG-3’，下游：5’-TCACCACAGCTGGGTTGGTATAAG-3’。Muc4引物序列：上游：5’-AGGCCAATGCAAGCACCTG-3’，下游：5’-AGTGTTCGCCCGAGGATGTA-3’。以总RNA为模板，用反转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，然后进行实时荧光定量PCR检测。

1.2.3免疫组织化学染色法检测Muc1、Muc4的表达将固定好的的细胞爬片放入24孔板中，山羊血清封闭，加入Muc1兔抗鼠多克隆抗体，4 ℃过夜；加二抗，PBS漂洗2次，加入DAPI室温避光孵育，甘油封片，荧光显微镜观察。以PBS代替一抗作为阴性对照。免疫组织化学染色结果判定：细胞质红色荧光着色为Muc1兔抗鼠多克隆抗体阳性，同种方法检测Muc4兔抗鼠多克隆抗体，并行角膜上皮细胞的鉴定检测(角化蛋白K3表达)。图片结果经IPP 6.0灰度分析软件计算出OD值，再进行统计学分析。

1.3统计学方法采用SPSS 15.0统计学软件处理数据。采用单因素方差分析以及t检验方法进行统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1细胞培养结果接种后培养48 h显微镜下即可见细胞从组织块向四周移行，形成典型的“沙滩样”移行带(图1A)。3～5 d大部分组织块上的细胞从移行带向外长出生长晕，细胞胞膜清晰，细胞类圆形，相互紧密连接呈膜状生长(图1B)。6～7 d生长基本达融合，细胞形态不规则，呈多角形，相互连接成片，细胞密度较前增加(图1C)。观察不同浓度DHT干预24 h后的细胞生长状态，发现除0.50 g·L-1、1.00 g·L-1DHT 干预组外，其他各组细胞生长状态良好；0.50 g·L-1、1.00 g·L-1DHT干预组培养基中出现DHT析出沉淀，尤其在 1.00 g·L-1DHT干预组，角膜上皮组织片贴壁性差，且细胞形态不规则，生长缓慢甚至死亡，无法进行免疫荧光化学实验。

2.2细胞鉴定结果形态学观察发现细胞呈卵圆形或多角形，从组织块向四周移行，细胞相互紧密连接呈膜状生长；原代培养的细胞特征性地表达了角化蛋白K3(图1D)，说明本实验体外培养的细胞为角膜上皮细胞。

2.3DHT对MucinsmRNA表达的影响空白对照组，0.05 g·L-1、0.10 g·L-1、0.20 g·L-1、0.50 g·L-1DHT干预组Muc1 mRNA相对表达量分别为1.00±0.00、0.15±0.01、1.40±0.09、0.07±0.11、0.06±0.02；Muc4 mRNA相对表达量分别为1.00±0.00、0.30±0.28、1.36±0.05、0.43±0.01、0.45±0.01，与空白对照组相比，0.10 g·L-1DHT干预组Muc1 mRNA与Muc4 mRNA表达上调，差异均有统计学意义(均为P<0.05)，而0.05 g·L-1、0.20 g·L-1、0.50 g·L-1DHT干预组的表达下降，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。

Figure 1 Corneal epithelial cells of mice cultured in vitro(×200).A:48 hours;B:3-5 days;C:6-7 days；D：Cell identification by K3 protein (red fluorescence,bar:50 μm) 小鼠角膜上皮细胞体外培养及鉴定。A：培养48 h(×200)；B：培养3～5 d(×200)；C：培养6～7 d(×200)；D：细胞鉴定(角化蛋白K3)结果(红色荧光)

2.4DHT对Mucins蛋白水平表达的影响免疫荧光化学染色结果显示，各组细胞均有黏蛋白的表达。Muc1蛋白(图2)、Muc4蛋白(图3)主要表达于细胞质上，呈红色荧光。细胞核经DAPI染色后显示为蓝色荧光。经过IPP软件分析光密度(OD)值发现(表1)，对于Muc1蛋白的表达，与空白对照组相比，0.10 g·L-1DHT干预组表达上调，而0.05 g·L-1DHT干预组以及0.50 g·L-1DHT干预组表达较空白对照组降低，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；0.20 g·L-1DHT干预组与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。对于Muc4蛋白的表达，与空白对照组相比，0.10 g·L-1以及0.20 g·L-1DHT干预组表达上调，差异均有统计学意义(均为P<0.05)，这两组间表达差异无统计学意义(P>0.05)；而0.05 g·L-1DHT干预组以及0.50 g·L-1DHT干预组表达较空白对照组降低，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。

表1 各组Muc1与Muc4免疫荧光OD值的比较Table 1 OD values of Muc1 and Muc4 by fluorescence immunohistochemistry(±s)

Figure 2 Expressive levels of Muc1 protein in corneal epithelial cells of each group 各组角膜上皮细胞Muc1蛋白表达水平

3 讨论

Figure 3 Expressive levels of Muc4 protein in corneal epithelial cells of each group 各组角膜上皮细胞Muc4蛋白表达水平

眼表黏蛋白对维持泪膜稳定性起着非常重要的作用，尤其是膜结合型Mucins，其与角膜上皮细胞微绒毛形态对维持泪膜的稳定性具有更为重要的意义，膜结合型Mucins为极化跨膜大分子物质，疏水端跨膜固定于角膜上皮的微绒毛上，而亲水端形成一个长尾巴，游离在泪膜中，以此方式将疏水性的角膜上皮细胞与亲水性的泪膜水样层联系起来，二者共同作用才将泪液通过瞬目运动均匀地涂布在角膜表面，同时保护上皮细胞免受瞬目摩擦带来的损伤，维持角膜上皮细胞的非角化特性[11]。而早在30 a前，已证明干眼动物中发生角膜上皮细胞微绒毛减少，绒毛突起、扁平等形态改变[12-13]。各种原因所致的Mucins合成减少，或者因角膜上皮微绒毛形态结构改变而对Mucins表达的间接影响，均可能导致泪膜稳定性降低[14]。本实验证实DHT对眼表Muc1、Muc4表达具有调节作用，因此，推测雄激素可通过对泪膜三层结构(脂质层、水样层、黏蛋白层)的影响，稳定泪膜功能。

本研究结果表明，0.10 g·L-1DHT可以上调小鼠角膜上皮细胞Muc1、Muc4 mRNA的表达，与Evanqelou等[10]研究结果一致，其证明DHT对前列腺癌PC-3细胞Muc1 mRNA表达有正向调节作用；对乳腺癌细胞研究结果也显示[15]，Muc1的表达是雄激素受体依赖性的，并影响细胞之间的黏附，从而参与癌细胞的转移等生物学行为。但本研究发现高浓度DHT干预后反而降低了角膜上皮细胞Muc1、Muc4的表达，可能是因为一方面过高浓度的DHT对角膜上皮细胞Muc1、Muc4表达可能存在抑制作用；另一方面通过对培养的角膜上皮细胞观察后发现，给予0.50 g·L-1与1.00 g·L-1DHT干预后培养基中出现DHT析出沉淀，角膜上皮组织片贴壁性差，且细胞形态不规则、多边，胞质中见空泡状改变，说明该浓度DHT干预后细胞生长状态不佳、细胞凋亡，推测过高浓度DHT对角膜上皮细胞有一定的毒性作用，结果导致Muc1、Muc4的表达随之降低。对于Muc4表达的调节作用，本研究结果显示，0.20 g·L-1DHT使mRNA表达下调，但对其蛋白表达具有上调作用，此种基因与蛋白水平调节的不一致性，需要进一步研究；此外，与空白对照组及0.10 g·L-1DHT干预组相比较发现，0.05 g·L-1DHT干预后，Muc1、Muc4无论基因水平还是蛋白水平，均表现为下降，目前其具体原因不明，期望在对机制的深入研究后可以进一步做出合理解释。

综上所述，合适浓度的DHT可上调小鼠角膜上皮细胞Muc1、Muc4的表达水平，进一步推测雄激素可能通过调节眼表泪膜黏蛋白的表达，从而起到稳定泪膜的作用。对以上现象的作用机制进行深入探索，将可能为干眼的研究和临床治疗开辟新的方向。

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date：Jan 22，2014

Youth National Science Foundation of China(No：81100647)；Science and Technology Project of Shaanxi Province(No：2010K16-04)From theDepartmentofOphthalmology，theFirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity，Xi’an710061，ShaanxiProvince，China

Effects of dihydrotestosterone on Mucins expression in corneal epithelial cells of mice

LI Li，GAO Ge，ZHENG Xuan，WANG Shuang-Mei，KANG Qian-Yan

androgen;dihydrotestosterone;mucin;corneal epithelial cell

Objective To study the effects of dihydrotestosterone (DHT)on Mucins expression in corneal epithelial cells of miceinvitro.Methods Corneal epithelial cells of BALB/c mice were cultured in vitro.Cells were divided into blank control group and DHT-treated group,the cells in DHT-treated group were treated by different concentrations of DHT (0.05 g·L-1,0.10 g·L-1,0.20 g·L-1,0.50 g·L-1,1.00 g·L-1)for 24 hours.Expressions of Mucin1 and Mucin4 mRNA and protein were measured by RT-PCR and fluorescence immunohistochemistry,respectively.Results The relative expressive levels of Muc1 mRNA in blank control group,and 0.05 g·L-1,0.10 g·L-1,0.20 g·L-1,0.50 g·L-1,1.00 g·L-1DHT-treated group were 1.00±0.00,0.15±0.01,1.4±0.09,0.07±0.11,0.06±0.02,respectively；MUC4 mRNA relative levels were 1.00±0.00,0.30±0.28,1.36±0.05,0.43±0.01,0.45±0.01,respectively.Compared with blank control group,Muc1 and MUC4 mRNA relative levels in 0.10 g·L-1DHT-treated group increased significantly (allP<0.05),but which in 0.05 g·L-1,0.20 g·L-1,0.50 g·L-1,1.00 g·L-1DHT-treated group all decreased significantly (allP<0.05).IOD values of Muc1 in above groups were 1.86±0.01,1.82±0.01,2.03±0.04,1.88±0.01,1.81±0.02,respectively.Compared with blank control group,IOD values of Muc1 in 0.10 g·L-1DHT-treated group increased significantly(P<0.05),but which in 0.05 g·L-1,0.50 g·L-1DHT-treated group all decreased significantly (allP<0.05);IOD values of Muc4 in above groups were 1.86±0.00,1.77±0.01,1.84±0.02,1.92±0.00,1.69±0.05,respectively.Compared with blank control group,IOD values of Muc4 in 0.10 g·L-1and 0.20 g·L-1DHT-treated groups increased significantly (allP<0.05),but which in 0.05 g·L-1and 0.50 g·L-1DHT-treated group all decreased significantly (allP<0.05).Conclusion Certain concentration of DHT (0.10 g·L-1)can up-regulate Muc1 and Muc4 expressions in corneal epithelial cells of mice in vitro,but high concentration of DHT (0.50 g·L-1and 1.00 g·L-1)may be toxic to cells.

黎黎，女，1980年11月出生，博士，主治医师。研究方向：眼表疾病。联系电话：029-85323960(O)；E-mail：eyelili2010@mail.xjtu.edu.cn

AboutLILi：Female，born in November,1980.Doctor degree.Tel：+86-29-85323960(O)；E-mail：eyelili2010@mail.xjtu.edu.cn

2014-01-22

国家自然科学青年基金(编号：81100647)；陕西省科技攻关项目(编号：2010K16-04)

710061 陕西省西安市，西安交通大学医学院第一附属医院眼科

康前雁，E-mail：kangqy@mail.xjtu.edu.cn

黎黎，高鸽，郑璇，王双梅，康前雁.二氢睾酮对小鼠角膜上皮细胞Mucins表达的影响[J]. 眼科新进展，2014，34(8)：701-704，709.doi：10.13389/j.cnki.rao.2014.0192

【实验研究】

修回日期：2014-03-27

本文编辑：付中静

Accepteddate：Mar 27，2014

Responsibleauthor：KANG Qian-Yan，E-mail：kangqy@mail.xjtu.edu.cn

[RecAdvOphthalmol，2014，34(8)：701-704，709]