静电场协同超声提取甘草中甘草酸的研究*

杨日福闵志玲陈维楚丘泰球

(1 华南理工大学 理学院 广州 510640)

(2 华南理工大学 轻工与食品学院 广州 510640)

1 引言

甘草具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓解止痛和调和诸药的功能，是常用中药材，被中医界奉为“药中之王”。甘草酸是甘草中的制药活性成分，近代众多临床医学研究表明，甘草酸可以有效抑制乙肝病毒(HBV)和感染细胞表面抗原(HbsAG)的分泌，并且可以明显地抑制HIV增殖，增强机体的免疫力[1]。甘草酸也是一种天然的甜味剂，其甜度为蔗糖的200～300倍，可广泛用于食品，饮料，医药等行业[2]。

目前甘草酸主要采用提取方法有水提法、稀氨水提取法及氨性醇提取法等[3]。虽然具有不需特殊设备，成本低等优点，但存在提取效率低，提取时间长，所得甘草酸纯度低等问题，对甘草资源的利用不充分，影响了我国传统中药甘草产业的发展。

超声波能够破坏药材细胞壁，使有效物质容易从药材中提取出来;与传统方法相比，具有提取率高、提取时间短、提取全过程无需高温、节能环保等优点。因此，超声提取技术已经作为中药提取的新方法、新手段被广泛应用[4－6]，但国内现有的超声提取装置中，功率和强度受超声探头的数量所制约，难以达到理想的提取效果。为了解决这些问题，近年来人们把目光投向几种工艺相互耦合技术上，例如:将超声与微波耦合提取[7]，超声与亚临界水耦合提取[8]等。将静电场引入协同超声提取，是功率超声的一个新兴应用领域，由于水分子是一种强极性分子，它的正负电中心不重合，存在分子电偶极矩，通过外加直流电场对水结构的影响，使水分子的排列更为有序，目前国内外关于超声－静电场协同处理取得了一定的进展:超声波和电场共同作用，加剧了液体中物质的扩散和溶解过程[9]。超声清洗过程中加入电场强化时，促进表面清洗效果[10－11]。超声波协同电催化提高有机物的降解效率[12]。但国内关于超声－静电场耦合技术还处于探索阶段，目前关于超声－静电场耦合提取植物有效成分应用研究较少。

本文将超声单独作用及超声和静电场协同作用下甘草酸的提取率进行比较，通过曲面响应法获取甘草酸的最佳工艺条件，并验证超声和静电场交互作用的存在。

2 材料与方法

2.1 材料与仪器

乌拉尔甘草，购于广州清平药材市场，干燥粉碎过60目筛;提取剂为水与乙醇混合溶液(1∶1);水为去离子水(美国Millipores纯水系统处理)，无水乙醇(分析纯，广州市东红化工厂)，甘草纯品，购自陕西慧科植物开发有限公司，纯度98%。

UV－5200紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司;KQ－100VDE三频数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;TDL－50B台式离心机，上海安亭科学仪器厂;101电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司;EST804A高精密双极性静电发生器，北京华晶汇科技有限公司。

静电场协同超声提取装置示意图如图1所示。

2.2 实验方法

2.2.1 甘草酸标准曲线制备与提取率计算

准确称取甘草酸纯品0.25 g，溶于50 mL体积分数为 50% 的乙醇溶液中;取 1，2，3，4，5 mL，用50%乙醇溶液稀释至250 mL，以50%的乙醇溶液作参比，在紫外波长254 nm处测其吸光度，得标准曲线为 C=(A－0.0076)/12.18746，相关系数 R2=0.9996;其中 C为甘草酸浓度值(μg/mL)，A 为其对应的吸光度。

在一定工艺条件下实验所得提取液经离心，过滤，用50%乙醇补充损失的体积，从滤液中取1 mL溶液加到100 mL容量瓶中，用50%乙醇溶液进行定容，在紫外波长254 nm处测定其吸光度，依据标准曲线可计算提取液浓度C，甘草酸提取率计算如下:

式中:C为标准曲线所得浓度值(μg/mL)，V为提取溶剂体积(mL)，M为甘草粉末质量(g)。

2.2.2 单因素对甘草酸提取率的影响

其它因素保持不变，分别考察浸泡时间、液固比、超声电功率、提取时间、超声频率、静电场电压等单因素对甘草酸提取率的影响。

2.2.3 响应曲面法优化甘草酸的提取工艺条件

用4因素3水平的Box－Behnken中心组合设计来确定最优的过程参数组合，这些因素包括液固比，提取时间，超声电功率和静电压，通过实验建立了超声提取工艺参数与甘草酸提取率之间的数学模型，获得最优的工艺参数。

用于预测最优条件的二次多项式模型的一般表达式如下:

其中，Y 是甘草酸提取率，β0，βj，βjj和 βij是模型的回归系数，Xi和 Xj是影响因素，而 ε是随机误差。

3 结果与讨论

3.1 浸泡时间对甘草酸提取率的影响

称5 g甘草粉末，加入100 mL体积分数为50%的乙醇溶液，超声频率为20 kHz，超声设备的输出电功率为100 W，提取时间30 min，分别考察无静电场和10 kV静电场正交作用，浸泡时间对甘草酸提取率的影响。结果如图2所示，结果表明随着浸泡时间增长，甘草酸提取率呈上升趋势，但是上升比较缓慢，且最终趋于平缓。说明浸泡时间可以提高甘草酸的提取率，但效果不是很明显。因此，为了缩短工时，减小能耗，下述实验不采取浸泡方法。

图2 浸泡时间对甘草酸提取率的影响Fig.2 Effect of immersed time on extraction yield of glycyrrhizic acid

3.2 液固比对甘草酸提取率的影响

其他条件同 3.1，溶剂用量分别为 50 mL、75 mL、100 mL、125 mL、150 mL，考察液固比对甘草酸提取率的影响。结果如图3所示，结果表明甘草酸提取率随着溶剂用量的增加而增加。这是由于溶剂量大，溶剂中的有效成分浓度低，物料及溶剂边界层的有效成分浓度差大，因而提取率较高;反之，溶剂中有效成分浓度高，扩散推动力小，不利于扩散，有效成分提取率低。图中曲线趋势可知溶剂用量为50 mL～100 mL时，提取率上升较快，在100 mL～150 mL时，趋于平缓，考虑液固比太大对后续分离处理带来不便，因此液固比采用传统提取较为常见的20 mL/g(溶剂用量100 mL).

图3 液固比对甘草酸提取率的影响Fig.3 Effect of liquid－solid ratio on extraction yield of glycyrrhizic acid

3.3 超声电功率对甘草酸提取率的影响

其他条件同3.1，超声电功率从40 W到100W间隔10W递增，分别考察超声电功率对甘草酸提取率的影响。结果如图4所示，结果表明超声波提取作用主要取决于超声波的功率，随着输入功率的增加，气泡逐渐增多，气泡的最大半径和膨胀压缩比增大，空化强度增强，从而有利于甘草中甘草酸提取率的提高。

但当超声功率达到一定阈值时，由于声源附近聚集大量气泡，形成空化屏蔽，声能被局限在声源表面不能传出去，空化强度不能进一步增加，因此提取率达到饱和不能继续增加;此外，大量空化泡将反射声波而减少了能量的传递，因此超声功率也不能无限制地提高。

图4 超声电功率对甘草酸提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction yield of glycyrrhizic acid

3.4 提取时间对甘草酸提取率的影响

其他条件同3.1，作用时间从10 min到60 min间隔10 min递增，分别考察作用时间对甘草酸提取率的影响。结果如图5所示，结果表明当提取时间从10 min增加到20 min时，提取率上升比较快，在20 min到30 min，提取率进一步上升，但上升速度明显减慢，而在30 min后提取率反而有下降。

图5 提取时间对甘草酸提取率的影响Fig.5 Effect of extraction time on extraction yield of glycyrrhizic acid

超声提取的主要推动力是有效成分浓度差，在提取初期，有效成分浓度差大，因此提取速率快，提取率增加明显，随着提取时间的延长，溶剂中有效成分浓度逐渐增大，和固相中的浓度差逐渐变小，推动力也变小，也就是提取液中甘草酸浓度已基本与甘草中甘草酸浓度达到平衡，所以提取速率慢慢减缓。同时，由于超声波长时间作用，更多杂质溶出，提取液经离心，过滤后，杂质的沉降带走部分甘草酸，导致溶液中甘草酸浓度将下降的结果。

3.5 超声频率对甘草酸提取率的影响

其他条件同 3.1，超声频率分别为 20 kHz、40 kHz、80 kHz、100 kHz时，考察超声频率对甘草酸提取率的影响。结果如图6所示，结果表明超声频率越低，提取率越高。这是因为超声空化现象能否发生与超声频率有直接的关系，频率越高产生空化的声压空化阈值越高，越难以发生空化。另一方面，在相同功率时，频率越低空化效应中的机械作用越强，频率越高，化学效应越明显，而超声波提取作用是空化作用破坏细胞壁，因此机械作用越强的低频空化效果更明显。

图6 超声频率对甘草酸提取率的影响Fig.6 Effect of ultrasonic frequency on extraction yield of glycyrrhizic acid

3.6 静电压对甘草酸提取率的影响

其他条件同 3.1，静电场电压分别 5 kV、7.5 kV、10 kV、12.5 kV、15 kV 时，考察静电场电压对甘草酸提取率的影响。结果如图7所示，结果表明静电压为10 kV前随着电压增加甘草酸提取率逐渐增加，但当电压超过一定临界阈值时，甘草酸提取率反而迅速下降，当静电压超过一定范围时，反而会对超声提取起到抑制作用。

在超声场中加入静电场，相对单独超声作用时提取率提升，说明静电场对超声场有促进作用，借鉴文献推测主要原因:(1)由于静电场的存在，对溶液产生微干扰，溶液中大直径气泡增多，增加了空化效应[13];(2)静电场作用使空化气泡产生形变，沿场强方向拉伸拉长，使空化泡变成椭圆形，使处于稳态空化核中一部分转化为瞬态空化，增加了空化效应的声化学产额[14－15]，从而提高了甘草酸的提取率。但是，根据文献[14]的研究可知，气泡的长径随电场升高而增大，短径随电场升高而减少，气泡的长径与短径之比同Weber数(定义为εE2r/σ，其中r为气泡的未变形的半径)相关联，势必导致空化泡的自然共振频率的改变，只有当空化泡的自然共振频率与使用超声的频率相近时，才能达到有效的能量耦合，对于一定的超声频率和声强，必定有一个最大效果的静电场电压与之对应。

图7 静电场对甘草酸提取率的影响Fig.7 Effect of electrostatic field on extraction yield of glycyrrhizic acid

3.7 采用响应曲面法优化提取工艺

3.7.1 分析因素的因素与水平选取

根据单因素影响的实验结果，选取液固比，提取时间，超声电功率和静电压4个影响因素，采用3水平的Box－Behnken中心组合实验设计，进行曲面响应分析优化，试验因素与水平设计见表1。

表1 甘草酸提取试验的因素与水平Table 1 Factors and levels in extraction experiments of glycyrrhizic acid

3.7.2 模型的建立及其显著性检验

实验设计方案和实验结果如表2所示，共29个实验点，其中1～24为析因实验，25～29为中心实验。29个实验点分为析因点和零点，其中析因点是由因素 X1，X2，X3，X4所构成的多维空间顶点，零点为区域的中心，零点实验共进行5次，用以估计实验误差[16]。

表2 响应曲面实验设计和结果Table 2 Response surface experimental design and results

利用Design－Expert软件对表2实验数据进行多元回归拟合[16]，得到甘草酸提取率对液固比(X1)，提取时间(X2)，超声电功率(X3)和静电压(X4)的二次多项回归模型如下:

对该模型进行方差分析和回归模型系数显著性检验结果见表3。

表3 甘草酸提取的二次多项式模型的方差分析Table 3 Analyses of variance for quadratic polynom ialm odel of glycyrrhizic acid extraction

由表3可得，液固比和超声电功率对提取率有极显著的作用，其次为提取时间和静电压。X3X4项的p值为0.0493，表明超声及静电场之间的交互作用很显著。另外，模型的p值＜0.0001，表明该数学模型能提供可靠的预测结果及能充分地代表过程变量和响应因素之间的真实关系。

3.7.3 过程优化

通过Design－Expert软件确立各因素的最佳提取条件的编码值为:X1=0.999957，X2=－ 0.107502，X3=0.999995，X4=－ 0.198262。变换成真实值可得:液固比为30 mL/g，提取时间为28.92 min，超声电功率为100 W，静电压为9.01 kV，在此条件下，甘草酸提取率理论值可达到11.08%。

为验证响应曲面法所得结果的可靠性，采用上述优化条件进行甘草酸的提取，考虑到施加操作的便利，将提取工艺参数修正为:液固比为30 mL/g，提取时间为29 min，超声电功率为100W，静电压为9 kV，在此条件下提取5次，实际测得的平均提取率为11.02%，与理论预测值相比，其相对误差约为0.53%。因此，基于响应曲面法所得的优化提取工艺参数准确可靠，其甘草酸提取工艺条件对甘草的综合利用以及甘草酸产业化具有理论指导意义。

4 结论

通过单因素试验结果，加入静电场，可强化超声提取甘草酸效率。运用曲面响应法分析也表明了超声与静电场存在交互作用。影响因素对甘草酸提取率影响的大小次序为:(液固比)＞(超声电功率)＞(提取时间)＞(静电压)。得出甘草中甘草酸的最优条件为:液固比为30 mL/g，提取时间为29 min，超声电功率为100 W，静电压为9 kV;在该条件下甘草酸的提取率为11.02%。综上所述，利用超声与静电场耦合提高甘草酸得率的方法在工业化应用上具有发展潜力，但是，静电场与超声场正交作用从实验结果来看不是十分明显，根据Sobotka等[17]进行直流电场对超声信号的振幅影响研究表明:超声－静电场正交耦合不及平行耦合效果显著，平行耦合效果有待今后进一步探索。

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