响应面法优化多棘海盘车消化腺、生殖腺酶解工艺

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（1.中国水产科学研究院黄海水产研究所，碳汇渔业实验室，山东青岛 266071；2.獐子岛集团股份有限公司，辽宁大连 116001）

多棘海盘车（Asterias amurensis）（以下简称海星）属于棘皮动物门（Echinodermata）、海星纲（Asteroidea）、海盘车科（Asteriidae），主要分布在我国黄海、渤海海域[1]。海星是一种底栖的海洋无脊椎动物，掠食扇贝、牡蛎、鲍鱼等海珍贝类，对沿海的贝类养殖危害巨大[2]。

海星具有发达的消化腺和生殖腺（统称为海星黄），其中含有丰富的营养成分[3]。另外，科研人员相继从海星中分离到皂苷、甾醇、生物碱、多糖等多种结构独特的化学物质[4]，这些化学物质表现出降血压、抑菌、抗病毒等多种生理和药理活性[5]。海星在食品、动物饲料、医药等领域均展现出良好的应用潜力。然而，海星目前尚未得到有效的开发利用，有关海星黄蛋白水解方面的研究也较少。大分子蛋白经酶解后，更有利于后续的加工利用，为丰富海星高值化加工利用的基础理论，本文以渤海产多棘海盘车为研究对象，研究了生物酶法在海星黄蛋白水解中的应用效果，并采用响应面法对酶解工艺进行了优化，以期为海星的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

多棘海盘车由大连獐子岛集团股份有限公司提供。

中性蛋白酶（1.3×105U/g）、菠萝蛋白酶（5.0×105U/g）、风味蛋白酶（1.5×104U/g）、复合蛋白酶（1.5×105U/g）购于青岛诺马科生物科技有限公司。其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 可溶性蛋白含量测定

取5.0 mL酶解液加入等体积的三氯乙酸（TCA）溶液（质量分数10%），静置20 min后，12 000 r/min离心20 min。取上清液，采用双缩脲比色法[6]测可溶性蛋白含量。

1.2.2 氨基酸态氮含量测定

参照GB/T 5009.39-2003《酱油卫生标准的分析方法》，采用比色法测定[7]。

1.2.3 水解度测定

大分子蛋白通过酶的作用降解为小分子的可溶性多肽和氨基酸，使得溶解性增加，因此可以用可溶性蛋白和氨基酸含量的增加表征蛋白质水解的程度。总蛋白含量的测定采用微量凯氏定氮法[6]。

按照如下公式计算水解度：

式中：DH（degree of hydrolysis）为水解度；P2为酶解液中可溶性蛋白含量，（mg/g）；P1为水解前海星黄匀浆液中可溶性蛋白含量，（mg/g）；N2为酶解液中氨基酸态氮含量，（mg/g）；N1为水解前海星黄匀浆液中氨基酸态氮含量，（mg/g）；N0为海星黄中蛋白质总含量，（mg/g）；9.14为氨基酸态氮与氨基酸含量之间的换算系数（以20种氨基酸平均分子量128计）。

1.2.4 气味组成分析

采用PEN3便携式电子鼻（德国AIRSENSE公司）检测酶解液气味组成。取样品1 mL，置于20 mL顶空瓶中，加盖密封。25℃恒温静置20 min，用电子鼻采集数据，采用系统自带软件进行数据处理。

1.2.5 水解用酶的筛选

取海星黄，加适量纯净水后匀浆。匀浆液分别添加中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶和复合蛋白酶，在各自适宜条件下，进行水解试验，测定酶解液水解度和气味组成。

1.2.6 单因素试验

确定试验用酶的基础上，进行底物质量浓度、酶用量、水解时间、pH、温度等单因素试验，考察各因素对水解度的影响。

1.2.7 响应面分析

应用Design Expert7.0软件，以水解度为响应值，基于单因素试验结果，选取底物质量浓度、酶用量和水解时间进行响应面试验设计，因素水平见表1。

表1 响应面试验设计因素水平表Table 1 Design of response surface analysis

1.2.8 数据处理

试验设3个平行，试验结果以平均值±标准偏差表示，采用软件SPSS 17.0进行数据统计分析，显著性检验采用ANOVA，以P＜0.01为极显著，P＜0.05为显著，P＞0.05为不显著。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶种类筛选

中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶和复合蛋白酶是水产动物蛋白水解的常用酶[8]。固定底物质量分数5%、酶用量2 000 U/g原料、水解时间90 min，4种蛋白酶在各自最适pH和温度条件下，对海星黄进行水解，其水解度分别为38.00%、25.64%、8.24%和27.47%。中性蛋白酶对应的水解度相对较高。

4种蛋白酶对应的酶解液气味如图1所示。

图1 酶解液气味组成分析Fig.1 Flavor analysis of enzymatichydrolysate

中性蛋白酶和菠萝蛋白酶对应的酶解液气味组成与原液基本一致，10 个传感器中，R（1）、R（3）、R（7）、R（9）的响应值略有增大。而风味蛋白酶和复合蛋白酶对应的酶解液气味组成与原液相差较大，其中R（6）和R（8）传感器的响应值明显增大（P＞0.05）。4种蛋白酶对应的酶解液气味在感官上均可接受，都具有海星特有气味且无明显腥、臭等不良气味。由于中性蛋白酶对应的水解度相对更高且价格便宜，因此作为后续试验用酶。

2.2 酶解条件单因素分析

以中性蛋白酶作为水解用酶，考察了底物质量分数（5%～20%）、酶用量（500 U/g～8 000 U/g）、pH（6.0～8.0）、温度（35℃～55℃）、时间（30 min～180 min）等条件对水解度的影响，结果见图2。单因素试验结果表明：采用中性蛋白酶对海星黄进行酶解，适宜的底物质量浓度为10%左右、酶用量为2 000 U/g原料左右、pH6.5～7.5、温度45℃、水解时间90 min左右。

图 2 底物质量分数（a）、酶用量（b）、pH（c）、温度（d）和水解时间（e）对水解度的影响Fig.2 Effectofsubstrateconcentration（a），dosageofenzyme（b），pH（c），temperature（d）andtime（e）onthedegreeofhydrolysis

2.3 酶解工艺的响应面优化

2.3.1 响应面试验结果与方差分析

在单因素试验基础上，根据中心组合设计原理，以水解度为响应值，选取底物质量分数、酶用量和水解时间进行响应面试验，试验设计和结果见表2。

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Results of response surface experiment

采用Design-Expert 7软件对表2数据进行分析，通过二次多元回归拟合，得到水解度对底物质量分数（A）、酶用量（B）和水解时间（C）的回归方程为：DH%=0.41+0.014A+0.043B+0.069C+4.186E-003AB+7.425E-003AC+2.709E-003BC-0.056A2-0.037B2-0.043C2

对模型进行方差分析，结果见表3。

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of the regression model

可以看出，模型的P值小于0.01，表明模型高度显著，而失拟项不显著（P＞0.05），说明方程对试验拟合较好。在所选取的因素水平范围内，各因素对水解度的影响均极显著，且影响大小依次为：C水解时间＞B酶用量＞A底物质量浓度。

2.3.2 响应曲面图分析

模型中AB、AC、BC交互项的响应曲面图见图3，三维曲面图越凸的位点表示响应值越大[9]，可以看出AB、AC、BC 交互作用均显著（P＜0.01），这和表 3的结果一致。

图3 因素A（底物质量分数）、B（酶用量）、C（时间）交互项的响应曲面图Fig.3 Interaction diagram of factor A（substrate concentration），B（enzymedosage）and C（time）

2.3.3 验证实验

通过DesignExpert对回归方程求解，得到海星黄最佳水解条件为：底物质量浓度11.0%、酶用量（以原料计）1 768 U/g、水解时间140min，水解度的理论值可达45.67%。在此条件下进行验证实验，3次试验的均值为44.82%，与理论预测值的相对误差仅为1.9%，说明该模型适宜对海星黄酶解工艺进行分析和预测。

3 讨论与结论

海星黄是优质的蛋白来源，通过酶解将大分子蛋白质水解为小分子肽和氨基酸，一方面有助于作为食品利用时的消化吸收[10]，另一方面获得的多肽可能具有潜在的生物活性[11]。利用酶工程技术水解海洋动物蛋白一直是研究的热点，研究领域主要集中在鱼[12]、虾[13]、贝类[14]，有关海星黄酶解的研究鲜有报道。

水解度是指蛋白质的肽键被裂解的程度或百分比[15]，可以表征大分子蛋白质被降解为小分子肽或氨基酸的程度。水解度的测定可以通过滴定释放出的质子（如pH-state法[16]）、检测可溶性蛋白或游离氨基酸含量的变化实现[17]。蛋白酶解过程中，可溶性蛋白和游离氨基酸含量可能同时增加，在酶解的不同时期两者产生的速率也有差别。本文为提高数据准确性，同时检测酸可溶性蛋白和游离氨基酸含量变化，将两者含量与不溶性蛋白的比作为水解度值。

响应面分析法在试验设计和结果表述方面具有独特优势[18]。本实验采用响应面法得到的海星黄水解工艺为：底物质量分数11.0%、酶用量（以原料计）1 768 U/g、水解时间140 min，此条件下水解度可达44%以上，所建立的二次回归模型可较好的模拟海星黄的水解规律，对于相关产品的开发和生产具有一定的参考价值。

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