TOLL样受体4对脂多糖致急性肺损伤大鼠炎症因子的影响

黄继义，刘才文，林建东，叶先龙，洪朝基，周 荣

TOLL样受体4对脂多糖致急性肺损伤大鼠炎症因子的影响

黄继义，刘才文，林建东，叶先龙，洪朝基，周 荣

目的 探讨TOLL样受体4(TLR-4)表达对脂多糖诱导急性肺损伤(ALI)大鼠体内炎症因子的影响，明确阻断TLR-4表达对急性肺损伤的保护作用。方法 45只雄性Wistar大鼠随机分为：正常对照组、ALI组和干预组，每组15只。ALI组和干预组采用静脉注射脂多糖(LPS)方法构建急性肺损伤模型，对照组注射等量的生理盐水。各组动物再按照观察时间点平均分为造模后6、12和24 h各3个亚组。测定各组肺组织TLR-4 mRNA表达以及支气管肺泡灌洗液中炎症因子浓度，观察各组大鼠肺组织的病理变化。结果 LPS可以导致肺泡腔内TNF-α、IL-1β和IL-6浓度增加，阻断TLR-4受体会抑制炎症因子释放；ALI组的肺损伤评分高于干预组和正常对照组(3.3±1.1 vs.1.9±1.0 vs.1.2±0.9)。结论 阻断TLR-4表达能抑制脂多糖诱导ALI大鼠体内炎症因子分泌，减轻肺组织病理损害，能达到治疗ALI的作用。

急性肺损伤；Toll样受体4；炎症因子

急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是全身炎症反应综合征(SIRS)最早出现的器官损害，可进一步发展为急性呼吸衰竭。ALI病情凶险，治疗困难，死亡率高，一直是临床治疗的棘手难题[1]。感染尤其是革兰阴性菌脓毒症是导致ALI的主要病因，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰阴性细菌外膜上的主要成分，LPS进入体内后，除本身对肺血管内皮的损伤作用外，可激活血小板、中性粒细胞、巨噬细胞以及补体系统和凝血系统等，促使内源性介质释放和炎症因子的过度分泌，造成肺组织的损伤，诱导实验性ALI模型[2]。研究发现，TOLL样受体4(TLR-4)炎症通路在这一过程中起重要作用[3]。本研究拟探讨TLR-4对脂多糖诱导ALI大鼠体内炎症因子表达的影响，阐明TLR-4拮抗剂对ALI的保护作用，为临床治疗和新药研发提供新的分子治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 模型制备和分组 健康雄性Wistar大鼠45只，体重180～200 g，由第二军医大学实验动物中心提供[合格证号:SCXK(沪)2007-0003]。实验前适应性喂养1 w后，随机分成3组：对照组，ALI组和干预组，每组各15只。肌注20%乌拉坦(5 ml/kg)，麻醉起效后，ALI组和干预组经阴茎背静脉缓慢注射LPS(5 mg/kg，Sigma，美国)以建立ALI模型；对照组注射等量的生理盐水。造模开始的同时，干预组腹腔内注射Eritoran 100 μg(CAS 185955-34-4，上海革远生物)，其余两组则腹腔内注射等量的生理盐水。各组动物再按照观察时间点平均分为造模后6、12和24 h各3个亚组，每亚组5只。各组大鼠于各时间点麻醉下开胸留取肺组织待检。

1.2 检测指标

1.2.1 肺组织病理分析 取右肺下叶用10%中性多聚甲醛固定24 h，常规石蜡包埋，4 μm切片，HE染色。光镜下取10个不同视野评估肺组织损伤程度。从肺组织水肿、出血、肺泡壁增厚、肺不张以及炎细胞浸润等方面综合判断，并分别计分。按每类病变累及肺野的范围计分：0分(无损伤)、1分(损伤范围<25%)、2分(损伤范围25%～50%)、3分(损伤范围50%～75%)、4分(损伤范围>75%)。各项相加得总分。

1.2.2 支气管肺泡灌洗液分析 室温下，用5 ml PBS(0.01 M)自左主支气管反复灌洗左肺3次，收集支气管肺泡灌洗液(BALF)，保证3组间BALF容量无差别，平均为(4.2±0.4)ml。全部灌洗液经4 ℃，2000 r/min离心10 min，取上清留存待检。采用ELISA试剂盒(R&D，美国)分别测定BALF上清液中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和IL-6浓度变化，每份标本重复测量3次，取平均值。

1.2.3 RT-PCR检测肺组织TLR-4 mRNA表达 取冻存右肺中叶组织50 mg，加1 ml Trizol，按Trizol试剂说明书操作，加焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水溶解RNA。取5 μg RNA，按invitrogen superscriptTMⅢ(invitrogen，美国)试剂说明书操作逆转录合成cDNA第1链。使用ABI7500全自动荧光定量PCR仪(美国ABI)进行检测。以GAPDH为内参照，TLR-4引物由Primer Express设计合成。GAPDH上游引物：5'-ATGTTCCAGTATGACTCCACTCACG-3'，下游引物:5'-GAAGACACCAGTAGACTCCACGACA-3'；TLR-4上游引物：5'-GAGGACTGGG TGAGAAACGA-3'，下游引物：5'-GAAACTGCCATGTCTGAGCA-3'。按说明书要求操作，反应结束后，经ABI7500 PCR仪自动分析荧光信号并将其转换为CT值。以内参GAPDH基因为内标，通过随机附带相对定量计算分析软件(RQ Study Software)对各样本TLR-4基因进行相对定量分析，计算RQ值(2-△△Ct)。

2 结果

2.1 肺组织病理学分析 光镜下HE染色显示：对照组大鼠在6、12和24 h时间点，均无明显的肺损伤病理改变；ALI组在造模6、12、24 h时，右肺下叶组织病理改变主要为肺泡壁水肿、出血、增厚伴肺泡腔炎细胞浸润，随着时间延长，病变程度加重；干预组在造模6、12、24 h时，肺组织结构改变均较ALI组减轻，其肺泡结构清晰，仅少量炎细胞浸润。对照组、ALI组以及干预组造模24 h后肺损伤评分分别为：1.2±0.9、3.3±1.1和1.9±1.0，ALI组评分显著高于其他两组(P<0.05)，而干预组与对照组间无显著差异(P>0.05)。

2.2 各时点各组支气管BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6含量 在6、12和24 h时点，各组支气管BALF中3种炎症因子表达水平均是：ALI组>干预组>对照组(P<0.05)。ALI组及干预组随着时间的延长，炎症因子浓度逐渐增加，同一组内各时点之间比较，差异有统计学意义(P<0.05)；而对照组随着时间延长，炎症因子表达无明显差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠BALF中炎症因子浓度比较(n=5,ng/L)

注：与对照组比较，①P<0.05；与同时间ALI组比较，②P<0.05

2.3 肺组织TLR-4基因表达 ALI组肺组织TLR-4 mRNA表达高于干预组和正常对照组，干预组肺组织TLR-4 mRNA表达高于对照组(P<0.05)。在6、12和24 h时点，各组TLR-4 mRNA的表达水平均是：ALI组>干预组>正常对照组(P<0.05)。随时间的延长，ALI组及干预组TLR-4 mRNA的表达水平逐渐降低，而对照组没有变化。见表2。

表2 各组不同时间肺组织TLR-4 mRNA的表达(n=5)

3 讨论

危重症患者多合并革兰阴性菌感染，由此而产生的内毒素血症，是引发ALI的主要原因[4]。以过度的全身炎症反应为特征的SIRS是ALI的发病基础，ALI就是SIRS在肺脏的表现，是其严重后果。LPS作为内毒素的主要成分，可以诱导肺损伤。本研究发现，静脉内注射LPS可以导致ALI病理改变，大鼠出现呼吸功能不全和炎症因子的释放，呈时间依赖关系，导致肺内众多炎症因子释放。同时肺组织TLR-4基因表达明显增加。阻断TLR-4受体后，肺组织内TLR-4基因表达明显减少，肺脏炎细胞浸润减少，同时抑制肺组织内炎症因子释放，支气管肺泡灌洗液内炎症因子浓度也大幅度减低。可见，阴茎背静脉注射一定剂量的LPS，可以成功诱导大鼠外源性ALI，建模成功。

Toll受体家族既为LPS的信号分子，也是LPS的受体[5]。TLR-4作为Toll受体家族成员之一，主要分布于单核-巨噬细胞表面，介导LPS炎症信号向胞内传导，是LPS的优先受体。目前研究发现，Toll样受体4是脂多糖信号向细胞内传导的“门户蛋白”，CD14-TLR-4-MD2膜受体复合物可能是LPS跨膜信号传导的基本途径之一。本研究发现在ALI大鼠模型中，术后6 h肺组织中TLR-4表达就明显增加，24 h达高峰，并与ALI损伤程度呈正相关关系，这与Zhang等[6]的研究一致。因此，针对TLR-4这一重要环节，进行特异性调节，可能为预防和治疗ALI提供新的途径。目前研究发现，E5564(Eritoran)是最重要的TLR-4拮抗剂。大量实验证实，E5564以剂量依赖的方式可以抑制LPS诱导的TNF-α及其他细胞因子产生。活体研究发现，E5564可抑制LPS诱导的细胞因子产生，从而减轻LPS对活体动物导致的致死性损害[3]。本研究干预组加用Eritoran进行处理后，使细胞因子表达减少，肺组织损伤减轻，也充分说明了这一点。因此，TLR-4拮抗剂有可能成为治疗LPS诱导急性肺损伤的一种很有希望的药物。

ALI/ARDS的本质是肺泡内炎症细胞(巨噬细胞、中性粒细胞等)激活触发的急性炎症反应。炎性细胞释放大量炎症介质，其中最具有代表意义的是TNF-α、IL-1β和IL-6[7]。炎症介质又进一步活化炎症细胞，通过级联瀑布反应，造成肺血管内皮细胞的损伤，肺微血管通透性增高，导致肺组织水肿、出血、纤维化。本研究发现，ALI模型组随着时间的延长，支气管肺泡灌洗液中炎症因子浓度逐渐增加，充分证明了这一点。

TNF-α作为一种促炎症介质，在炎症刺激早期释放，参与炎症反应的多个重要进程。IL-1β主要由白细胞特别是单核-巨噬细胞合成和分泌，是非常重要的促炎症介质之一，参与机体的炎症及免疫调节过程。同时它还诱导血管内皮细胞表面黏附分子，活化巨噬细胞、粒细胞，刺激单核-巨噬细胞合成IL-6、IL-8等因子[8]。本研究也发现，TNF-α、IL-1β和IL-6在建模后各个时间点的变化趋势基本一致。

此外，本研究还发现，静脉注射LPS引起ALI表现为毛细血管内皮细胞损伤，肺部微血管通透性增大，水肿液及中性粒细胞向肺间质渗出，蛋白含量升高，病理改变以微血管充血、水肿液分布于肺间质内为主。区别于直接肺部疾患导致的肺损伤，其病理改变以肺泡上皮细胞、肺泡壁断裂为主，低氧血症为主要表现。这提醒人们对于临床上ALI患者要分析病因，区别对待，才能获得最好的疗效。

总之，TLR-4的表达在LPS诱导的大鼠ALI模型的发展过程中起重要作用，阻断TLR-4受体可以抑制肺组织炎症因子的释放，减轻肺组织病理损害，达到治疗ALI的作用。

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Effects of TLR-4 on inflammatory factor in rats with acute lung injury induced by lipopolysaccharide

Huang Jiyi1,Liu Caiwen1,Lin Jiandong2,Ye Xianlong1,Hong Chaoji3,Zhou Rong4

1.Department of Internal Medicine,Tongmin Hospital,the First Affiliated Hospital of Xiamen University,Xiamen,Fujian,361000,China;2.Intensive Care Unit,the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou,Fujian,350000,China;3.Department of Internal Medicine,Xiamen Medical Research Institute,Xiamen,Fujian,361000,China;4.Department of Emergency,the First Affiliated Hospital of Xiamen University,Xiamen,361000,China

Objective To discuss the effects of Toll-like receptor(TLR)4 expression on the inflammatory factors in rats with acute lung injury induced by lipopolysaccharide,and to explore the protection effect of blocking the TLR-4 expression on acute lung injury.Methods Forty five male Wistar rats were randomly divided into normal control group,ALI group,and intervention group with 15 ones in each group.In ALI and intervention groups,the models of acute lung injury were established by the method of intravenous injection with lipopolysaccharide(LPS).The control group

the injection with the same volume of normal saline.All the animals were divided into subgroups of 6,12,and 24 h according to the observation timing of the modeling.Detection was made in the TLR-4 mRNA expression in the lung tissues of those animals and the concentration of the inflammatory factors in the bronchoalveolar lavage fluid.The pathological changes in the rats' lung tissues were observed.Results LPS could lead to the increase of TNF-a,IL-1β,and IL-6 in alveolar space.Blocking the TLR-4 receptor could inhibit the release of inflammatory factors.The evaluation score of lung injury in ALI group was higher than those in the intervention and normal control group(3.3±1.1 vs.1.9±1.0 vs.1.2±0.9).Conclusion Blocking TLR-4 expression can inhibit the secretion of inflammatory factor in ALI rats model induced by LPS,relieve the pathological lesion of lung tissues,and cure ALI.

acute lung injury;Toll-like receptor 4;inflammatory factor

361000 福建 厦门，厦门大学附属第一医院同民分院内科(黄继义，刘才文，叶先龙)；福建医科大学附属第一医院ICU(林建东)；福建省厦门医科所内科(洪朝基)；厦门大学附属第一医院急诊科(周 荣)

R 614

A

1004-0188(2014)01-0023-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.01.009

2013-09-27)