云南牛肝菌的内生真菌分离、鉴定和ITS序列特征研究

岳万松，熊 勇，2，陈毅坚，2，*

（1.云南民族大学化学与生物技术学院，云南昆明 650500;2.国家民委—教育部共建民族药资源化学重点实验室，云南昆明 650500）

牛肝菌科（Boletaceae）是担子菌亚门伞菌目的重要一科。云南是野生食用菌的王国，目前已知牛肝菌有224种，食用菌144种，分别占全国总数的62%和72%。牛肝菌含有多糖、生物碱、甾醇类化合物、酸类化合物等活性物质，可用于治疗腰腿疼痛、手足麻木、四肢抽搐等疾病，还具有抗流感病毒、防治感冒的作用［1］。在云南产量多、味道鲜美、又具经济价值的有4种:小美牛肝菌（地方名见手青）［Boletus speciosus Frost］、铜色牛肝菌（地方名黑牛肝）［Boletus aereus］、黄皮疣柄牛肝菌（地方名黄牛肝、黄癞头）［Leccinum crocipodium］、美味牛肝菌（地方名白牛肝）［Boletus edulis］［2］。至今，牛肝菌除个别种据报道在实验室条件下栽培成功［3－6］，绝大多数种类尚不能通过人工栽培形成子实体［7－8］。目前有关野生食用牛肝菌的研究主要集中在其营养成分分析［9－10］和化学成分分析［11－12］，此外，多篇文献［13－15］对牛肝菌活性物质多糖的免疫、抗肿瘤及抗氧化作用进行了研究分析。

内生真菌定殖于健康的生物组织内，种类繁多，分布广泛［16］。近年来，内生真菌的代谢产物的研究倍受关注，大量具有抗菌、抗癌、杀虫等活性的次生代谢产物从内生真菌中分离出来［17－19］，内生真菌已经成为开发活性物质资源库。目前国内外对大型真菌的内生真菌方面的研究甚少，仍需进一步研究。本文以产自云南的牛肝菌不同种为材料，分离、纯化其内生真菌并进行形态特征研究，再结合rDNA ITS序列分析进行分子鉴定，确定内生菌株的种属归类，旨在为牛肝菌内生真菌资源的开发利用提供研究基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛肝菌 实验用新鲜牛肝菌子实体小美牛肝菌（地方名见手青）、铜色牛肝菌（地方名黑牛肝）、黄皮疣柄牛肝菌（地方名黄牛肝、黄癞头）、美味牛肝菌（地方名白牛肝），均于2013年8～9月分别购自云南省玉溪市和曲靖市集贸市场，新鲜子实体用保鲜袋包装带回实验室，24h内完成内生真菌的分离;引物ITS4、ITS5和 DNA MarKer 北京博迈德生物;2×Power Taq PCR MasterMix 北京百泰克;分离培养基 配制根据参考文献［20］完成;固体培养基Ⅱ KH2PO40.5g，MgSO40.25g，酒石酸铵 1g，麦芽糖 0.25g，维生素B1 0.5mL（40μg/L），葡萄糖 10g，琼脂粉 10g，蒸馏水500mL（pH6.0），121℃，灭菌 20min 后备用;液体培养基Ⅱ 配方同上，勿加琼脂粉。

Eppedorf 5331 PCR仪 德国;GENE GENIUS凝胶成像系统 美国;DYY－GB电泳仪、DYCP－31DN电泳槽 北京六一。

1.2 实验方法

1.2.1 牛肝菌内生真菌的分离纯化培养 取新鲜的牛肝菌子实体，自来水冲洗数次，去除表面杂质，无菌水冲洗3遍，75%乙醇漂洗3min，再用无菌水冲洗3～5次。用无菌解剖刀将牛肝菌子实体的表皮去掉，将内部的组织切割成0.5cm左右的小块，接种于培养基中，28℃恒温培养5～7d。待组织小块周围有内生真菌长出后，挑取少许菌丝培养物，纯化培养后，部分转接至固体培养基Ⅱ斜面上保存备用;另一部分转接至液体培养基Ⅱ里（培养条件为:150r/min，28℃恒温培养3～4d），每12h观察菌种生长情况，最后用无菌滤纸过滤得到菌丝体，存于－70℃冰箱里待用。

1.2.2 牛肝菌内生真菌菌落特征和显微特征观察 将分离纯化得到的牛肝菌内生真菌菌株于培养基Ⅱ平板上三点种植和插片培养5～7d，菌落长出后用于观察，插片置于显微镜下观察显微形态特征，对菌株进行初步鉴定。

1.2.3 牛肝菌内生真菌分子鉴定

1.2.3.1 DNA提取 将分离的牛肝菌内生真菌液体培养获得的菌丝体用于提取DNA，总DNA提取方法参照 CTAB－SDS 法［21－22］并加以改良，用琼脂糖凝胶电泳检测样品DNA质量。

1.2.3.2 PCR 扩 增、测 序 ITS 通 用 引 物 （ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC;ITS5:GGAAGTAAAA GTCGTA－ACAAGG）［23］，50μL 反应体系包括:25μL 2 ×Power Taq PCR Mixture，引物各2μL，5μL DNA 模板，16μL ddH2O;反应条件:预变性 94℃ 5min，94℃30s，52℃ 30s，72℃ 30s，35 次循环，72℃ 10min，4℃保存。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，采用Bio－Rad凝胶成像系统观察结果。

1.2.3.3 PCR 产物的纯化、测序及系统发育树的构建PCR产物用多功能DNA纯化回收试剂盒回收，送昆明硕阳科技有限公司测序。测序结果DNAMAN进行拼接，MEGA 5.13分析相关数据，构建发育树，同时将得到的序列提交GenBank数据库，并通过在线Blast工具从NCBI下载GenBank等数据库内已知同源序列多条作为参考序列，用 MEGA 5.13中的Kimura－2－parameter（K2P）模型，邻接（neighborjoining method，N－J）法构建聚类图。并应用 DNA STAR和RNAVIZ2.0预测其二级结构。

2 结果与分析

2.1 牛肝菌内生真菌的形态特征

从4种新鲜牛肝菌子实体内部组织块中分离培养获得5株内生真菌纯菌株，编号为YX1－6、YX1－7、QJ3－6、QJ3－7、QJ3－8，5 株内生真菌的菌落特征和显微特征见图1，特征描述记录和初步鉴定结果见表1（鉴定结果参考中国科学院微生物研究所编写的《常见与常用真菌》完成［24］）

图1 牛肝菌内生真菌 YX1－6、YX1－7、QJ3－6、QJ3－7、QJ3－8在培养基Ⅱ上的生长特征Fig.1 Morphology and hyphal structure of YX1－6，YX1－7，QJ3－6，QJ3－7 and QJ3－8 isolated from boletus

2.2 不同牛肝菌内生真菌菌株ITS序列PCR扩增结果

分离获得的牛肝菌5株内生真菌的PCR扩增结果见图2。

从图2可见，5株菌序列长度约在430～630bp之间，PCR产物均出现比Marker清晰明显的条带，说明实验所提的DNA质量较好。

2.3 牛肝菌内生真菌rDNA ITS序列NJ树构建及分析

分离到的内生真菌分成5组:YX1－6、YX1－7、QJ3－6、QJ3－7和 QJ3－8 分别各为 1 组，做序列相似性比对并构建系统发育树以NCBI中的ITS序列为聚类外群，采用N－J法对不同牛肝菌内生真菌进行分析并构建遗传关系树，自举检测1000次。所构建的系统树见（图3）。

表1 牛肝菌内生真菌特征记录和初步鉴定结果Table 1 The preliminary identification results endophytic fungi from boletus

图2 5株牛肝菌内生真菌菌株ITS－PCR扩增电泳图Fig.2 Amplification profile of electrophoretogram ITS－PCR of 5 strains of boletus endophyte

通过在线BLAST工具从NCBI数据库内下载已知的多条相似序列作为参考序列，比较它们的相似性，并用 MEGA 5.13 中的 Kimura－2－parameter（K2P）模型，邻接（neighbor－joining method，N－J）法构建发育树（见图3），NJ发育树分析结果表明:YX1－6与NCBI数据库里的多株Trametes hirsuta形成自检支持率为99%的一个分支，它们亲缘关系较近，且BLAST比对结果显示:YX1－6与Trametes hirsuta相似性都很高，为99%，鉴定为毛栓菌（Trametes hirsuta）。NJ发育树分析结果表明:YX1－7与NCBI库里的多株Chaetomium aureum形成自检支持率为99%的一个大分支，二者亲缘关系很近，且BLAST比对结果显示:YX1－7与多株Chaetomium aureum相似性较高，为99%，鉴定为金色毛壳菌（Chaetomium aureum）。NJ发育树分析结果表明:QJ3－6菌株与Candida sp（DQ104728）、Candida sp（KF057545）、Candida sp（KF057544）等假丝酵母属菌株形成自检支持率为100%的一个分支，它们的亲缘关系较近，且BLAST比对结果显示:QJ3－6菌株与多株Candida sp相似性高达99%，鉴定为假丝酵母属真菌（Candida sp）。NJ发育树分析结果表明:QJ3－7菌株与多株Mortierella sp形成自检支持率为100%的一个分支，亲缘关系较近，且 BLAST比对结果显示:QJ3－7菌株与Mortierella sp（KC180749）相似性高达100%，鉴定为被孢霉属菌株。NJ发育树分析结果表明:菌株QJ3－8与Eurotium amstelodami多株菌株形成自检支持率为96%的一个分支，亲缘关系较近，且BLAST比对结果显示:QJ3－8与Eurotium amstelodami（AF455470）、Eurotium amstelodami（HQ728257）和Eurotium rubrum（AF455528）等多株散囊菌属菌株的的相似性都高达100%，鉴定为散囊属真菌。

2.4 牛肝菌内生真菌及其NCBI数据库相似种ITS rRNA二级结构比较

利用DNA STAR和RNAVIZ2.0预测并比较牛肝菌内生真菌及其NCBI数据库相似种的二级结构，牛肝菌内生真菌及其NCBI数据库相似种编号分别为YX1－6和Trametes hirsuta（JN048768、YX1－7和Chaetomium aureum（HQ607894）、QJ3－6 和Candidasp（DQ104728）、Mortierellasp（FJ810149）、Eurotium amstelodami（HQ728257），5株牛肝菌内生真菌及其NCBI数据库相似种ITS rRNA二级结构异同点见表2。

图3 根据rDNA ITS基因序列构建的牛肝菌内生真菌与参考类群间的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of boletus endophyte based on rDNA ITS and reference taxa

表2 牛肝菌内生真菌及其NCBI数据库相似种ITS rRNA二级结构比较Table 2 Contrast and analysis of ITS ribosomal RNA secondary structure ofboletus endophyte and their similar species in NCBI database

3 结论和讨论

本文的实验研究，从云南牛肝菌4个种的新鲜子实体中分得5株内生真菌，用经典分类方法和分子生物学方法鉴定为:YX1－6为毛栓菌（Trametes hirsuta），YX1－7为金色毛壳菌（Chaetomium aureum），QJ3－6 为假丝酵母属真菌（Candidasp.），QJ3－7 为被孢霉属真菌（Mortierellasp.），QJ3－8 为散囊菌属真菌（Eurotiumsp.），从分类结果可见不同种的牛肝菌的内生真菌也不同，显示了内生真菌的多样性特征。

进一步用DNA STAR和RNAVIZ2.0分析软件预测了它们的二级结构，用于分析研究其分类地位。分析结果显示各分离菌株及其相似种的ITS序列二级结构均为一个中心环及多个螺旋区构成，每个螺旋上又有或多或少的大小不一的茎、环结构，说明牛肝菌内生真菌既具有结构上的共性，又具有鲜明的个性差异。

真菌种类繁多，形态复杂，因此需要采用形态、结构、生理生化等表型方面的特征和各种分子生物学手段进行分类鉴定。该论文对牛肝菌内生真菌的分类鉴定，在形态结构和分子水平上都进行了研究，所得结果一致并可相互印证，可见对内生真菌分类研究，采用综合性手段的必要性和可靠性。

［1］黄自来.中国食用菌百科［M］.北京:中国农业出版社，1993:56－59.

［2］王海坤，李涛，赵丹丹，等.两株滇产广义美味牛肝菌的分离培养及其分子鉴定［J］.云南植物研究，2007，29（5）:559－562.

［3］ McLaughlin DJ.Environmentalcontroloffruitbody development in Boletus rubellus in axenic culture［J］.Mycologia，1970，62:307－331.

［4］Pantidou M，Watling R.Fruit－bodies of Boletus amarellus in pure－culture［J］.Notes from the Royal Botanic Garden，1973，32:439－443.

［5］Yamanaka K，Namba K，Tajiri A.Fruit body formation of Boletus reticulatus in pure culture［J］.Mycoscience，2000，41:189－191.

［6］Ohta A，Fujiwara N.Fruit－ body production ofan ectomycorrhizal fungus in genus Boletus in pure culture［J］.Mycoscience，2003，44:295－300.

［7］黄年来.中国大型真菌原色图谱［M］.北京:中国农业出版社，1998.

［8］吴晓刚.牛肝菌的分离培养及磷酸盐转运蛋白基因的克隆［D］.昆明:云南大学，2012.

［9］朱萍，郭永红，丁晓雯，等.四种鲜牛肝菌成分分析［J］.中国食用菌，2006，25（4）:44－45.

［10］冮洁，李学伟，金怀刚.美味牛肝菌菌丝体与子实体蛋白质营养价值的评价［J］.食品科学，2013，34（3）:253－255.

［11］沈杰.远东疣柄牛肝菌的化学成分［D］.杨凌:西北农林科技大学，2003.

［12］刘佳，殷忠，高敏，等.野生牛肝菌化学成分分析及遗传毒性研究［J］.微量元素与健康研究，2007，24（3），3－4.

［13］李志洲.美味牛肝菌多糖的抗氧化性［J］.食品与发酵工业，2007，33（4），49－51.

［14］李娜.泰山美味牛肝菌多糖提取纯化及功能研究［D］.泰安:山东农业大学，2008.

［15］唐薇，鲁新成.美味牛肝菌多糖的生物活性及其抗S－180肿瘤的效应［J］.西南师范大学学报:自然科学版，1999，24（4）:478－481.

［16］Petrini O.Fungal endophytes of tree leaves［C］//Andrews J H，Hirano S S eds.Microbial ecology of leaves.New York:Springer－Verlag，1991:179－197.

［17］Strobel G，Stierle A，Stierle D.Taxomyces andreanae:a proposed new taxon for a bulbilliferous by phomycete associated with pacific yew（Taxus brevifolia）［J］.Mycotaxon，1993，38（3）:214.

［18］黄忠京，杨瑞云，白丽娟，等.南海红树林内生真菌ZSUH26生物碱类代谢产物的研究［J］.化学研究与应用，2009，21（11）:1566－1570.

［19］Harper J K，Ford E J，Strobel G A，et al.Pestacin:a 1，3－dihydro isobenzofuran from Pestalotiopsis microspora possessing antioxidant and antimycotic activities［J］.Tetrahedron，2003，59:2471－2476.

［20］刘琼波，苏开美，白永顺，等.美味牛肝菌的菌种分离培养实验初探［J］.食用菌，2007（4）:25－26.

［21］曾大兴.适于RAPD分析的真菌DNA提取方法［J］.生物技术，2003，13（2）:2.

［22］江树勋，邵碧英，陈文炳，等.15种常见食（药）用菌的3种总DNA提取方法比较研究［J］.食品科学，2004，25（5）:37.

［23］WhiteTJ，Bruns TD，Lee SB，et al.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics［A］.In:Innis MA，Gelfand DH，SninskyJJ eds，PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications［M］.NewYorks:Academic Press，1990:315－321.

［24］中国科学院微生物研究所《常见与常用真菌》编写组.常见与常用真菌［M］.北京:科学出版社，1978.