采用高效液相一测多评法对保和丸中陈皮和连翘的含量测定研究

杨 艳，张秀丽

(1.山西省食品药品检验所，山西太原 030001;2.繁峙县人民医院，山西繁峙 034300)

保和丸始载于《丹溪心法》，最早为水丸，由焦山楂、炒六神曲等8味药组成，具消食、导滞、和胃作用，主要用于食积停滞、脘腹胀满等症。现有161个生产企业，216个批准文号，大、小蜜丸、水丸和浓缩丸4种剂型。浓缩丸执行标准为《卫生部药品标准》中药成方制剂第七册，除性状外，仅收载有3味药的显微鉴别。为控制本产品质量，故拟增加非标方法陈皮中橙皮苷及连翘中连翘酯苷A的含量测定项。

1 仪器与试药

仪器:WATERS Acquity UPLC超高效液相色谱仪，二极管阵列检测器(沃特世科技有限公司)。

试药:乙腈为色谱纯;水为纯化水;冰醋酸为分析纯;其他试剂均为分析纯。

对照品:连翘酯苷A、橙皮苷(供含测用，批号分别为L-012-110921、110721-200613)，均购于中国药品生物制品检定所。

样品:药都制药集团股份有限公司(生产批号:110304)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 色谱柱的选择 a)资生堂 C18柱(5 μm，4.6 mm ×250 mm);b)自装柱富士填料 C18(5 μm，4.6 mm × 250 mm);c)Allitima C18(5 μm，4.6 mm ×250 mm)。分离良好，柱温: 室温，流 速:0.7 mL·min－1。

2.1.2 流动相的选择 实验过程中共选择了以下2种流动相系统:

a)流动相A为乙腈，流动相B为0.5%冰醋酸溶液，线性梯度洗脱:0 min— A∶B=10∶90;60 min—A∶B=50∶50;b)流动相A为甲醇，流动相 B为0.5%冰醋酸溶液［1］，线性梯度洗脱:0 min—A∶B=10∶90;60 min— A∶B=50∶50。

结果表明，流动相系统中以第一种，即流动相A为乙腈，流动相 B为0.5%冰醋酸溶液，梯度洗脱0 min—A∶B=10∶90;60 min— A∶B=50∶50为最佳，谱图上各个色谱峰的分离度较好，保留时间适中。因此选此流动相作为保和丸的含量测定的流动相(见表1)。

表1 流动相 %Table 1 Mobile Phase %

结果:采用以上色谱柱及流动相均能达到良好的分离效果(见图1～3)。

图1 连翘酯苷A对照品HPLC色谱图Fig.1 HPLC Chromatogram Map of Forsythiaside A Controls

图2 橙皮苷对照品HPLC色谱图Fig.2 HPLC Chromatogram Map of Hesperidin Controls

图3 保和丸供试品HPLC色谱图(1.连翘酯苷A对照品，2.橙皮苷对照品)Fig.3 Baohe Pills and Samples HPLC Chromatogram Map(1.horsythiaside A controls，2.hesperidin controls)

2.1.3 检测波长的选择 参照《中国药典》2010年版一部连翘药材、陈皮药材［含量测定］项下方法［2］，选择二极管阵列检测器，波长范围190 nm～400 nm，提取280 nm波长处的色谱图，色谱图分离良好。

2.2 供试品提取方法的考察

2.2.1 提取溶剂的考察 分别采用50%甲醇、70%甲醇、85%甲醇、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇超声提取及加热回流法［3］，通过比较，采用70%甲醇加热回流提取法效果最佳。

2.2.2 提取时间的考察 采用加热回流提取法，分别加热30 min、45 min、60 min，结果见表2。

表2 提取时间考察结果 mg·g－1Table 2 The Inspection Results of Extraction Time mg·g－1

结果表明:加热回流45 min与60 min含测结果虽相差不多，但考虑到能使大蜜丸充分溶散，故将加热回流时间定为60 min。

2.3 专属性实验

分别取处方中除连翘、陈皮外的全部药味，按本品工艺及供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液，注入液相色谱仪进行测定，结果表明:在连翘酯苷A、橙皮苷保留时间处无干扰。

2.4 耐用性实验

用不同仪器:日本岛津LC-2010AHT型高效液相色谱仪，Agilent1200高效液相色谱仪;不同色谱柱:a)资生堂 C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm);b)自装柱 富 士 填 料 C18(5 μm，4.6 mm× 250 mm);c)AllitimaC18(5 μm，4.6 mm ×250 mm)，均能达到良好的分离效果。

2.5 线性关系的考察

精密称取连翘酯苷A对照品9.56 mg，置100 mL量瓶中，加70%甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。另精密称取橙皮苷10.18 mg，置50 mL量瓶中，加70%甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。按不同进样量依法测定，以峰面积值为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，测得连翘酯苷A回归方程为:A=1E+0.6X+806.4，r2=0.999，表明在0.019 ～ 0.956 μg范围内有良好的线性关系;橙皮苷回归方程为:A=3E+0.6X+32 918，r2=0.999，表明在0.102 ～ 2.036 μg范围内有良好的线性关系。

2.6 精密度考察

取同一供试品(批号110304)溶液，同一进样量，连续进样6次，按实验条件依法测定，结果RSD连翘酯苷A为2.2%，橙皮苷为0.3%，符合要求。

2.7 稳定性考察

取同一供试品(批号110304)溶液，每隔一定时间同一进样量，按实验条件依法测定，结果表明供试液在36 h内稳定，RSD分别为:连翘酯苷A为2.7%，橙皮苷为1.0%，符合要求。

2.8 重复性考察

按拟订含量测定方法，对同一批号(批号110304)的6份样品进行平行实验，依法测定，平均含量连翘酯苷 A 为0.684 5 mg·g－1，橙皮苷为4.358 0 mg·g－1;RSD:连翘酯苷A为1.4%，橙皮苷为0.79%。

2.9 准确度实验

采用加样回收法，取上述重复性实验所用的样品(1103041批)，取1 g(9份)，精密称定，分别精密加入连翘酯苷 A 对照品约0.5 mg、0.7 mg、0.8 mg，橙皮苷对照品约3.4 mg、4.3 mg、5.3 mg，按拟定含测方法制备，依法测定，计算回收率，结果见表3。

回收率=［测得总量－(取样量×重复性测得含量)］/加入对照品量×100%。

表3 回收率测定结果Table 3 Determination Results of Recovery Rate

2.10 限度确定

根据中国药典2010年版一部项下规定，结合连翘、陈皮含量限度，按处方量及转移率30%计算，暂定限度为:本品每克含连翘以连翘酯苷A计，不得少于0.1 mg·g－1，含陈皮以橙皮苷(C28H34O15)计，不得少于1.2 mg·g－1。

3 样品的测定

依法对107批次样品进行测定，测得结果分别为橙皮苷:最低0.232 mg·g－1，最高4.871 mg·g－1，107批次浓缩丸50批次不合格，占46.7%;连翘酯苷A最低0.064 mg·g－1，最高2.391 mg·g－1，107 批次浓缩丸6批次不合格，占5.6%。

4 讨论

4.1 标准项目缺失比较严重

不仅无法实现本品的标准可控和质量安全有效的目标，而且难以发现以次充好、以假充真、偷工减料等违法行为。因此，必须进一步提高和完善本品的现行标准。

4.2 部分药材质量状况堪忧

本次抽验107批次样品标准检验和探索研究发现，虽未发现擅自不按处方投料、改变工艺等违法行为，但质量方面的问题比较突出。

4.3 先进技术手段明显缺乏

本品现行标准仅有显微鉴别，未能采用一测多评等专属性强、灵敏度高的先进技术手段和方法进行鉴别和含量测定，无法实现对本品整体质量的有效控制。因此，本品现行标准中应积极引进先进的技术手段和方法，以确保质量控制的全面准确和科学深入。

［1］梁 艳，郜凤香.高效液相色谱法测定木香分气丸中橙皮苷含量［J］.中国药业，2013，22(8):52-53.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典(2010年版一部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010.

［3］孟 和，朱艳红，吴学军.HPLC法测定保和丸中连翘苷的含量［J］.中国药事，2013，27(3):312-314.