甘遂在不同配伍中大戟二烯醇的含量变化研究

钱金梅，阎改香

(山西省人民医院，山西 太原 030012)

黄仰模等［1］在《金匮要略讲义》中讲解了甘遂半夏汤，方由甘遂、半夏、芍药、甘草、白蜜组成，张仲景用之治疗留饮。方中甘遂降逆，攻逐饮邪，善行肠间经隧之饮邪;半夏燥湿醒脾，化饮降逆，宣畅气机;芍药补血益阴缓急;甘草益气和中;蜜性甘缓，益气和中，缓和甘遂与甘草之相反［2］。方中甘遂配伍甘草为配伍禁忌，但从古至今不断有医家报道配伍使用后无明显毒副作用［3］。以往对甘遂半夏汤的研究主要以临床应用为主，对其中化学成分的研究以含量变化为指标的少，同时，对甘遂的研究主要集中在药物炮制、化学成分分析以及药理作用等方面。本实验采用高效液相色谱法对单味甘遂、对药甘遂－甘草和甘遂半夏汤中大戟二烯醇的含量变化进行研究，以确定甘遂半夏汤中甘草等对大戟二烯醇溶出程度的影响，为临床合理应用甘遂半夏汤提供可靠依据。

1 实验材料

1.1 仪器

高效液相色谱系统:Altech 426HPLC Pump，UVIS-201型二极管阵列检测器，色谱柱为Dikma Diamonsil C8 色谱柱(200 mm ×4.6 mm，5 μm)。天平:METTLERTOLEDO AB135-S型十万分之一天平，HANPING FA2104型万分之一电子天平(上海精科天平);KQ-500型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 药物与试剂

甘遂、甘草(甘肃)安国市康达中药材有限公司，半夏(四川)毫州市万珍中药饮片厂，白芍(安徽)安国市神禾中药材饮片有限责任公司，大戟二烯醇标准品(购于中国药品生物制品，批号:111866-201001)，甲醇(分析纯，天津市进丰化工有限公司)，乙酸乙酯(分析纯，天津市光复科技发展有限公司)，乙腈(色谱纯，美国)，纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

图1 光谱图Fig.1 Chroma Togram Map

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Dikma Diamonsil C8色谱柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相:乙 腈 － 水 (94∶6)，流速:1.00 mL·min－1，检测波长:210 nm(见图1)，进样量:10 μL，柱温:室温。在此色谱条件下，各种供试品溶液大戟二烯醇与其他成分的分离度良好(见图2～6)。

图2 大戟二烯醇对照品色谱图Fig.2 Chromatogram Map of Euphadienol Controls

图3 生甘遂色谱图Fig.3 Chromatogram Map of Raw Kansui

图4 单药色谱图Fig.4 Chromatogram Map of Single Drug

图5 对药色谱图Fig.5 Chromatograms Map of Medicine

图6 群药色谱图Fig.6 Chromatogram Map of Groups of Medicine

2.2 对照品溶液的制备

精密称取对照品大戟二烯醇12.00 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得1.2 mg·mL－1的大戟二烯醇对照品溶液，作为母液备用。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 生甘遂供试品溶液 取本品粉末(过四号筛)约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙酸乙酯25 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率50 KHz)40 min，放冷，再称定重量，用乙酸乙酯补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.3.2 甘遂单煎液 称取甘遂药材约2 g，精密称定，用量筒量取220 mL水，浸泡30 min，回流提取2次，每次30 min，纱布过滤，合并滤液。将滤液置于烧杯中，浓缩至100 mL，药液放冷，加水饱和乙酸乙酯萃取4次，每次50 mL，合并萃取液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移到5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.3.3 甘遂－甘草对煎液 称取甘遂约2 g、炙甘草约4 g，精密称定，用量筒量取220 mL水，浸泡30 min，回流提取2次，每次30 min，纱布过滤，合并滤液。将滤液置于烧杯中，浓缩至100 mL，药液放冷，加水饱和乙酸乙酯萃取4次，每次50 mL，合并萃取液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移到5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.3.4 甘遂半夏汤煎液 称取甘遂约2 g、炙甘草约4 g、半夏约6 g、白芍约10 g，精密称定，用量筒量取220 mL水，浸泡30 min，回流提取2次，每次30 min，纱布过滤，合并滤液。将滤液置于烧杯中，浓缩至100 mL，药液放冷，加水饱和乙酸乙酯萃取4次，每次50 mL，合并萃取液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移到5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 将母液加甲醇分别稀释至0.12 mg·mL－1，0.24 mg·mL－1，0.48 mg·mL－1，0.60 mg·mL－1，0.96 mg·mL－1，经0.45 μm 微孔滤膜滤过后，作为对照品溶液备用。

精密吸取对照品溶液，按“2.1”项下 HPLC色谱条件进样，记录峰面积(数据见表1)，以对照品溶液的峰面积为纵坐标，以加入的对照品量为横坐标进行线性回归，作一直线，见图7。回归方程为y=32 180x+2 155.4，相关系数r=0.999 1。结果表明大戟二烯醇的进样量在1.2 ～12 μg范围内线性关系良好。

表1 线性关系考察结果HuTable 1 Investigation Results of Linear Relation Hu

图7 大戟二烯醇线性关系图Fig.7 Relationship Map of Euphadienol Controls

2.4.2 精密度考察 取浓度为0.48 mg·mL－1的大戟二烯醇对照品溶液10 μL，按照“2.1”项下 HPLC色谱条件进样，重复进样6次，以大戟二烯醇峰面积积分值为指标测定其精密度，实验结果见表2。

表2 精密度试验结果 HuTable 2 Test Results of Precision Hu

从实验结果看，6次测定值的RSD为2.58%，精密度良好。

2.4.3 稳定性考察 分别取同一浓度供试品溶液(生甘遂供试品溶液、甘遂单煎液、甘草－甘遂对煎液、甘遂半夏汤煎液)分别于0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h进样分析，记录峰面积，实验结果见表3。

表3 稳定性试验结果(n=6)HuTable 3 Experiment Results of Stability(n=6) Hu

结果表明4种供试品溶液在10 h内稳定性良好，RSD 分别为2.73%、1.12%、2.21%、0.68%。

2.4.4 重复性试验 分别取生甘遂、甘遂单煎液、对药甘遂－甘草和甘遂半夏汤各6份，按供试品溶液的制备方法制备样品溶液，进行HPLC测定，实验结果见表4。

表4 重复性试验结果(n=6)mg/gTable 4 Experiment Results of Repeatability(n=6) mg/g

从实验结果看，各种供试品溶液测定结果的RSD值测分别为2.44%、2.24%、1.88%、2.82%。

2.4.5 加样回收率试验 取已知煎出率的单味甘遂药材、对药甘遂－甘草药材、群药材各6份，每份约相当于甘遂1 g，精密称定，分别加入大戟二烯醇对照品，按供试品溶液测定方法操作，计算回收率，实验结果见表5。

表5 加样回收率Table 5 Recovery Rate

从实验结果看，本方法分析误差较小，回收率高， 方法可靠，各种供试品溶液测定结果的RSD值分别为1.27%、0.85%、1.57%。

3 讨论

3.1 提取方法的选择

实验考查了萃取法、干膏超声提取法、水提醇沉法3种方法，其中水提醇沉法提取后，仪器根本检测不出大戟二烯醇;干膏超声提取时考察了两种溶剂，用甲醇作溶剂时，制进样后柱压升高太多，用乙酸乙酯作溶剂时进样后不出峰，因为穿透力不强;最后采取萃取法，此法有效成分提取效果最佳。

3.2 萃取方法的选择

在进行样品提取时，需要用乙酸乙酯进行少量多次萃取。在萃取过程中，常常出现乳化现象，尤其在甘遂半夏汤的药液萃取过程中乳化程度比较严重。为减少乳化层，采用了如下方法进行解决:a)将分液漏斗置于铁架台上静置时，用玻璃棒搅动乳化层，乳化层减少不明显。b)在萃取液中加入少量无水Na2SO4晶体并用玻璃棒轻轻搅动乳化层，乳化层的减少并不明显。c)用吸管吸取少量甲醇，伸入乳化层滴两滴后，用玻璃棒轻轻搅动乳化层，同时用电吹风吹乳化层，效果仍不理想。d)将分液漏斗下端用塑料包好，放入超声波清洗器中超声数分钟，乳化层几乎没有变化。e)将最后一次萃取时的乳化层留在分液漏斗中，往其中加入50 mL蒸馏水，乳化层变薄，借助电吹风吹乳化层，基本可消除乳化。

3.3 色谱条件的选择

大戟二烯醇属于三萜类化合物，本实验采用键合相极性较高的 C8柱(200 mm ×4.6 mm，5 μm) ，以流动相为乙腈 －水(95∶5)进行洗脱，检测波长为210 nm［5］，柱温为室温，样品中被测成分大戟二烯醇峰分离不完全。为出现较好的色谱峰型，改变流动相的比例，以流动相乙腈－水(94∶6)，柱温为室温进行测定，峰形较好，分离较完全。

4 结论

实验结果表明古代医家所言甘草与甘遂相反是正确的，张仲景创立的甘遂半夏汤也有其妙处，甘遂与甘草合用后再加入半夏、白芍，缓和了甘遂甘草合用产生的毒性。

近年来，市面上出现了单味中药的颗粒剂，为了患者方便服用，根据处方即可直接将单味颗粒合并冲服，是否对疗效有太多影响有待进一步研究。

［1］黄仰模，陈国权，乔 模，等.金贵要略讲义［M］.北京:人民卫生出版社，2003.

［2］高永强.甘遂半夏汤方解随想［J］.国医论坛，2009，24(3):3-4.

［3］杨志军，邓 毅，王 昕，等.甘遂与甘草配伍对小鼠肝脏组织中MDA、GSH-PX影响的实验研究［J］.中医研究，2006，19(7):15-16.

［4］程显隆，肖新月，李广华，等.甘遂中大戟二烯醇和表大戟二烯醇的含量测定［J］.药物分析杂志，2009，29(9):1444-1447.

［5］中华人民共和国药典编委会.中华人民共和国药典一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010.