CYP2C19基因型与奥美拉唑治疗消化道溃疡疗效的相关性

梁 艳,刘振华,白清清,陈 虹

CYP2C19基因型与奥美拉唑治疗消化道溃疡疗效的相关性

梁 艳1,刘振华1,白清清1,陈 虹2

目的 探讨CYP2C19基因型与奥美拉唑治疗消化道溃疡的效果之间是否存在明确的相关性，以期为临床用药提供指导。方法 收集北京郊区二级医院胃十二指肠溃疡病史患者200例，使用基因组DNA快速提取试剂盒，采用Realtime-PCR方法，分析CYP450家族代谢酶的基因多态性；使用ABI7500fas型荧光定量PCR仪，对P450的6种基因型进行分析判读，用直接计数法计算其基因型频率及等位基因突变频率，运用Hardy-Weinberg平衡定律对基因型分布吻合度进行检验，并对基因型间有无性别差异，等位基因突变频率有无差异进行χ2检验。结果 服用奥美拉唑治疗胃十二指肠溃疡的效果与其基因型相吻合,慢代谢型患者使用奥美拉唑效果及pH值提高时间明显优于快代谢组；慢代谢组使用奥美拉唑效果更好。结论 北京郊区汉族人群P450家族代谢酶的三种基因类型间无性别差异，与欧洲白种人基因突变频率存在明显差异。其中，CYP3A4*18未检出纯合型突变，CYP450 2C19的基因型是影响奥美拉唑效果的重要因素。

CYP450; CYP2C19; 消化道溃疡; 奥美拉唑

消化道溃疡在我国人群中发病率高，复发率高，并发症严重，是消化系统疾病中最常见的疾病之一，其治疗主要包括抑制胃酸分泌、黏膜保护、胃肠动力药及根除幽门螺杆菌等。奥美拉唑是目前针对消化道溃疡应用最早且最广泛的有效药物，在体内经肝细胞微粒体中CYP2C19代谢，催化生成羟基奥美拉唑而失去活性[1]。患消化道溃疡的不同个体在使用奥美拉唑治疗时，效果大相径庭，有的患者在最大耐受剂量时仍不能控制病情，复发率高，导致如此巨大差异的因素有生理因素、病理因素、环境因素等，但经大量孪生子研究和家系研究证明，遗传因素才是导致个体和人群药物反应差异的决定性因素[2]。遗传突变引起药物反应差异主要来自于编码CYP2C19基因的基因多态性[3]。本研究选择消化道溃疡病史患者，检测其CYP2C19*2、*3基因型，分析其与奥美拉唑疗效相关性，可为个体化用药提供理论及临床依据。

1 对象与方法

1.1 对象 收集北京郊区二级医院(长辛店医院、大兴医院)2009-01至2012-09消化内科患者300例，从中筛选出胃十二指肠溃疡病史患者200例，年龄29～79岁，平均(57.63±1.52)岁，性别不限。排除标准：(1) 消化道肿瘤;(2)肝肾功能不全;(3)肝脏疾病及手术后;(4)合并严重心脑血管疾病服用多种药物;(5)根据研究者判断有可能增加患者危险的情况或者难于获得实验资料的情况;(6)不愿签署知情同意书者。

1.2 主要试剂 PuxegeneDNA抽提试剂盒由Gentra公司提供，TaqDNA聚合酶及相关试剂、LATaqDNA聚合酶及相关试剂、限制性内切酶SSP1(TaKaRa Biotech公司)，限制性内切酶 Sau3AI(Mbol)(New England Biolab公司)，DNAMarker(MBI公司)，琼脂糖(BIOWEST公司), dNTP(Asngon), 引物合成(上海生物工程有限公司)。

1.3 主要仪器 cenirifuge5415R冷冻变速离心机、BiophPtometer紫外分光光度仪、MastereyelerPCR仪(Eppendorf公司)。DYCP-31C型电泳仪(北京六一仪器厂)、VDS凝胶成像系统(Syngene公司)、电子天平(Sartorius公司)、Vortex-2震荡器(SI公司)、恒温循环水浴箱(Helo公司)、微波炉、各规格微量加样器及IMX药物浓度分析仪(Abbott公司)。

1.4 血样制备 采集肘静脉血标本3 ml，加入含EDTA抗凝剂的真空抽血管中，轻颠倒数次混匀，放置4 ℃冰箱保存备用。

1.5 外周血DNA提取 (1)取血样300 μl，加入700 μl细胞裂解液于离心管中，上下颠倒离心5～6次混匀。室温放置10 min，期间上下颠倒离心管2～3次，裂红细胞；(2)使用低温离心机以15 000 r/min，吸弃上清液；(3)使用涡旋振荡器振荡，使含白细胞的沉淀物重悬；(4)向重悬细胞溶液中加入300 μl核裂解液，立即使用加样枪吹打使其充分混匀；(5)向核裂解物中加入RNA酶溶液1.5 μl,并上下颠倒离心管2～5次混匀，37 ℃孵育1 min，继而冷却至室温；(6)向核裂解物中加入蛋白沉淀液100 μl，用涡旋振荡器振荡15 s；(7)使用低温离心机以15 000 r/min离心样本3 min；(8)取上清液移至装有300 μl异丙醇的离心管中；(9)轻轻颠倒以混匀溶液，至白色线状DNA形成沉淀，15 000 r/min离心1 min；(10)弃去上清，加入75%乙醇300 μl，轻轻上下颠倒离心管数次，吸走乙醇溶液。将离心管倒置在干净的吸水纸上，自然干燥10～15 min；(11)向离心管中加入DNA溶解液100 μl；(12)所得DNA溶液于-80 ℃贮存备用。用紫外分光光度计对DNA进行浓度和纯度测定：OD260/OD280≈1.8(>1.9,表明有RNA污染；<1.6，表明有蛋白质、酚等污染)。合格的标准为纯度大于1.6小于2.0且浓度大于20 ng/μl。最后，标本统一调整为20 ng/μl，个别标本由于原液浓度在10～20 ng/μl，统一调整为10 ng/μl。

1.6 DNA扩增及基因分型

1.6.1 Real time-PCR引物设计 PCR引物设计目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物的优劣直接关系到PCR的特异性与有效性。引物设计时应遵循以下几条基本原则[4]：(1)引物应在核酸序列保守区内设计并具有特异性;(2)产物不能形成二级结构;(3)引物长度一般在15～30个碱基;(4)G+C含量在40%～60%;(5)碱基要随机分布;(6)引物5′端可以修饰;(7)引物3′端不可修饰;(8)引物3′端要避开密码子的第3位。

通过辅助设计程序Primer对引物进行分析优化，确定CYP2C9*3；CYP2C19*2；CYP2C19*3；CYP2D6*10；CYP3A4*18；CYP3A5*3 PCR引物(表1)。

表1 CYP2基因引物序列

1.6.2 探针设计 探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易，探针的设计可以遵循以下几条基本原则[5]：(1)探针位置尽可能地靠近上游引物;(2)探针长度应在15→45 bp(最好是20→30 bp)，以保证结合特异性;(3)检测探针的DNA折叠和二级结构;(4)Tm值在65→70 ℃，通常比引物Tm值高5→10 ℃，GC含量在40%→70%;(5)探针的5′端应避免使用鸟嘌呤(G)，因为5′G有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用;(6)整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量(G含量高会降低反应效率)，这时就应选择配对的另一条链作为探针。

在设计引物时应该注意所选序列的特殊性和扩增目的片段是否有特殊要求，这种情况下要对上述原则作出某种程度上的修订。选用的引物和荧光探针要求设计在基因中的保守区，只对特定基因、人特异，和其他物种无交叉反应;荧光探针位于一对引物之间的区域。对检索的P450各个亚型序列，在引物设计软件Primer Express的辅助下，设计出两条荧光探针(表2)，各基因突变位点信息为CYP2C9*3，RS号1057910，突变位点编码1075A>C；CYP2C19*2，RS号4244285，突变位点编码681 G>A；CYP2C19*3，RS号4986893，突变位点编码636 G>A；CYP2D6*10，RS号1065852，突变位点编码100C>T；CYP3A4*18，RS号28371759，突变位点编码878T>C；CYP3A5*3，RS号1065852，突变位点编码6986A>G。

表2 CYP2基因检测探针序列

1.6.3 PCR反应体系 PCR Master Mix购自上海超世生物科技公司。PCR Master Mix包含了经过优化的缓冲液、dNTP、化学修饰的Taq CE DNA聚合酶和MgCl2溶液混合液，使用时只需加入适量的引物、探针和待检测样品，即可进行Real-time PCR检测[6]。

PCR Master Mix使用化学修饰、去核酸酶、去甲基化的Taq CE DNA聚合酶和MgCl2溶液混合物，为PCR反应提供了更高的产量及灵敏度、特异性。能够检测低至10个拷贝的目的基因，并最终产生高达7个数量级的动态范围结果[7](表3)。

表3 25 μl反应体系内容

1.6.4 PCR反应条件 将各反应管放入ABI7500 fast 荧光定量PCR仪，按下列条件扩增：95 ℃,10 min，然后按95 ℃10 s→60 ℃45 s，40个循环。50 ℃2 min，95 ℃10 min，然后按95 ℃15 s→60 ℃1 min，50个循环。

1.7 结果分析条件设定 ABI7500 fast基线设定：选择“适合基线(adaptive baseline)”设定时的荧光信号。阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点为准[8]。结果判读[9]:(1)阴性结果判定：如果增长曲线不呈S形曲线或Ct值>35，则待测样品判定为阴性；(2)阳性结果判定：如果增长曲线呈S形曲线且Ct值>35，则实验结果判为阳性。以上判定标准如果任何一条不符合, 需重复实验一次，若重复实验结果显示为增长曲线呈S形曲线且Ct值≤35，则判为阳性；否则判定为阴性。三种基因型荧光定量PCR检出结果(图1)。

图1 基因型荧光定量PCR检出结果

1.8 结果验证 按照上述方法及步骤用同一样本进行PCR扩增，反应体系中不加入对应探针，只进行PCR扩增。扩增反应结束后将反应EP管从ABI7500机器中取出于4 ℃保存。将PCR扩增产物使用ABI 3730型测序仪进行序列测定[10]，读取PCR产物序列。

使用测序所得结果与Realtime-PCR方法所得结果一致。结果准确性为100%，未出现漏检错检。

1.9 服用奥美拉唑后疗效

1.9.1 分组 选取经过CYP450 2C19基因检测的胃十二指肠溃疡患者入组，分为快代谢组(n=160)和慢代谢组(n=40)，给予奥美拉唑(洛赛克，20 mg/粒，阿斯利康公司生产)口服治疗，1粒/d，早餐前服用，疗程为4周，服用药物前及服用药物后1周、2周、3周、4周分别观察其疗效。

1.9.2 观察指标 包括pH值、腹痛、反酸、腹胀和嗳气。医师于用药前和用药的第1～4周对患者的pH值及上述症状进行检测评价。腹痛严重程度评分标准：0分：无腹痛；1分：轻度，患者需注意方能察觉有腹痛；2分：中度，有腹痛，但不影响生活；3分：重度，腹痛影响日常生活。其他症状记录的标准为有或无。

1.9.3 疗效评价 包括pH值、腹痛消失率(腹痛完全消失的比率)和腹痛缓解率(其严重程度的评分减少，但未完全消失的比率)。其他症状只评价是否完全消失率。

2 结 果

2.1 一般情况 服用奥美拉唑200例，慢代谢组(CYP2C19*2/*3、*2/*2、*3/*3)入组40例；快代谢组(CYP2C19*1/*1、*1/*2、*1/*3)入组160例。治疗前患者存在腹痛、反酸、嗳气和腹胀等症状及腹痛严重程度记分无明显差异。治疗后症状变化：服用奥美拉唑治疗胃十二指肠溃疡患者中，各组间每周的pH值及腹痛消失比率有显著差异，慢代谢组用药第1周pH值为3.8，腹痛缓解率为48%，至第4周pH值提高至5.6，腹痛缓解率为98%。在第1周，快代谢组的pH值为3.5，腹痛缓解率为47%；第4周pH值在4.9，腹痛缓解率为85%，明显低于慢代谢组(P<0.05)。慢代谢组的腹胀和嗳气缓解率在用药第4周为95%，快代谢组为81%。用药期间两组患者最终的缓解率有明显差异。服用奥美拉唑治疗胃十二指肠溃疡的效果与其基因型相吻合，慢代谢型患者使用奥美拉唑效果及pH值提高时间明显优于快代谢组(表4)。慢代谢组使用奥美拉唑效果更好。

2.2 CYP450各基因型比例和等位基因频数 检测300例患者CYP450基因结果如下：CYP2C9基因野生型纯合子AA型为276例(92%)，杂合子AC型为10例(7%)，突变型纯合子CC型为14例(1%)，A、C等位基因频率分别为99%和1%。 CYP2C19*2野生型纯合子GG型为276例(56%)，杂合子GA型为10例(37%)，突变型纯合子AA型为14例(7%)，G、A等位基因频率分别为93%和7%；CYP2C19*3野生型纯合子GG型为276例(88.8%)，杂合子GA型为10例(11.1%)，突变型纯合子AA型为14例(0.1%)，G、A等位基因频率分别为99.9%和0.01%；CYP2D6*10野生型纯合子CC型为276例(27%)，杂合子CT型为10例(46%)，突变型纯合子TT型为14例(27%)，C、T等位基因频率分别为73%和27%；CYP3A4*18野生型纯合子TT型为276例(96.8%)，杂合子TC型为10例(3.4%)，突变型纯合子CC型为14例(0%)、T、C等位基因频率分别为96.8%和3.4%；CYP3A*3野生型纯合子AA型为276例(8.5%)，杂合子AG型为10例(27.5%)，突变型纯合子GG型为14例(64%)。A、G等位基因频率分别为36%和64%。均符合Hardy-Weinberg平衡遗传定律(P>0.05)。

表4 消化性溃疡患者基因与药物代谢差异数据比较

3 讨 论

CYP分为18个家族和44个亚家族，CYP450以CYP1、CYP2和CYP3为主，各有8～10个亚家族同工酶，这3种CYP450占肝内CYP450总量的70%，介导人体内绝大多数药物(外源性化合物)的代谢。其中CYP3A占的比例最大，约占肝内CYP450总量的30%，其次是CYP2，约20%；CYP1A2占13%；CYP2E1占7%；CYP2A6占4%；CYP2D6占2%。研究发现，这些酶的活性在个体间存在很大差异，有的可以达到100倍，其中CYP450酶基因多态性因素是造成P450活性个体间差异的主要因素，但与性别无关。

本研究表明，北京郊区汉族人群P450家族代谢酶 CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2D6*10、CYP3A4*18、CYP3A5*3的基因存在多态性，各基因型分布规律不同。3种基因类型间无性别差异。样本具有种群代表性，与欧洲白种人基因突变频率存在明显差异。其中CYP3A4*18未检出纯合型突变，3A4*18基因不是造成3A4酶活性改变的因素。

奥美拉唑治疗效果与其基因型相吻合，CYP450 2C19的基因型是影响奥美拉唑效果的重要因素。本研究结果说明CYP2C9*3、 CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2D6*10、CYP3A4*18、CYP3A5*3基因型，从分子水平探讨与CYP450相关的药物相互作用，并分析CYP450酶基因分布规律，能够设计出适合不同个体特点的用药及配伍，最大限度地提高药物的有效性和安全性。

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(2013-10-19收稿 2013-12-09修回)

(责任编辑 郭 青)

Correlative studies on CYP2C19 with peptic ulcer patients using omeprazole

LIANG Yan1，LIU Zhenhua1，BAI Qingqing1，and CHEN Hong2.

1. Department of Pharmacy, General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100039, China; 2. Department of Clinical Pharmacology, Logistics University of Chinese People’s Armed Police Force, Tianjin 300162，China

Objective To study CYP2C19*2 and *3 genotype with peptic ulcer patients using omeprazole in order to confirm therapeutic effect on CYP2C19 genotype with omeprazole whether there is a clear correlation and to guide clinical drug use. Methods 200 patients with gastroduodenal ulcer disease from Beijing outskirts secondary hospital were recruited, genomic DNA quick extraction kit and realtime-polymerase chain reaction (PCR) were used,the family of CYP450 gene polymorphism of metabolic enzymes was analyzed,ABI7500fas type fluorescent quantitative PCR was employed.Six genotypes of the P450 were analyzed , direct counting method was used to calculate the mutation genotype frequency and allele frequency. Hardy Weinberg of genotype distribution law was used to examine alignment and the presence of gender differences between genotypes and alleles mutation frequency difference by chi-square test. Results The effect of omeprazole treating gastroduodenal ulcer coincides with its genotype, the effect of omeprazole in patients with slow metabolism and pH increase time were remarkably better than patients with quick metabolism. Conclusions P450 family metabolic enzymes of the Han people in suburb Beijing have gene polymorphisms,but no gender differences between three types of gene.There exists obvious difference in the white European gene mutation frequency, and in CYP3A4*18 the homozygous mutations are not detected , 3A4*18 gene is not the main factor of 3A4 enzyme activity change. Omeprazole treatment effect is consistent with its genotype, CYP450 2C19 genotype is an important factor affecting the effects of omeprazole.

CYP450; CYP2C19; peptic ulcer; omeprazole

武警总医院苗圃基金(WZ2011046)

梁 艳，硕士，副主任药师，E-mail: ly.w.j@163.com

1.100039北京，武警总医院药剂科；2.300309天津，武警后勤学院临床药理教研室

陈 虹，E-mail: chenhongtian06@163.com

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