金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的制备与释放性能研究

王莹+张龙+刘天晴

摘要：以壳聚糖为壁材、聚乙二醇400为助溶剂，采用离子诱导法制备油溶性药物金雀异黄素纳米粒子，通过负染-电镜、傅里叶红外光谱、紫外-可见分光光度法等方法对该纳米粒子的形貌、组成、包裹率及载药率、体外释放性能进行测定。结果表明：根据优化工艺制备的该纳米粒子的粒径为200～300 nm，包裹率和载药率分别为37.1%和93%；所获得的金雀异黄素纳米粒子对药物具有明显的缓释效果。

关键词：金雀异黄素；壳聚糖；纳米粒子；制备；药物缓释

中图分类号： TQ460.6文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）02-0226-03

收稿日期：2013-10-31

基金项目：江苏省研究生科技创新计划（编号：CXZZ13_0893）。

作者简介：王莹（1988—），女，江苏镇江人，硕士研究生，主要从事胶体与界面化学研究。E-mail：yingw1988@126.com。

通信作者：刘天晴，博士，教授，博士生导师，主要从事胶体与界面化学研究。Tel：（0514）87975290；E-mail：tqliu@yzu.edu.cn。金雀异黄素是大豆异黄酮的主要成分，又称染料木素、染料木黄酮，是源于豆类植物和齿状植物的异黄酮类化合物，其化学名为4，5，7-三羟异黄酮，具有多种生理或药理活性[1-2]。金雀异黄素在分子的相对两极带有2个酚羟基，溶于乙醇等有机溶剂，不易溶于水，因此直接口服生物利用率较低。壳聚糖是由自然界广泛存在的几丁质经过脱乙酰作用得到的，不仅是具有良好生物相容性和可降解性的天然生物材料，也是自然界中唯一大量存在的阳离子聚合物，由于其特有的性质且价格低廉，已成为新型的纳米药物载体。目前，利用壳聚糖为包璧材料制备药物微胶囊的方法有共价交联法、离子诱导法以及自组装法等。其中共价交联法由于经常使用的交联剂如甲醛、戊二醛等有机物含有一定的毒性，无法适用于体内给药；自组装法虽对控制大分子药物的释放具有一定的优势，但其制备方法较为繁琐；离子诱导法是制备壳聚糖纳米粒最为普遍的1种方法，制备条件温和、工艺简单、条件可控[3-7]，但该方法一般只适用于亲水性药物。本研究首次将离子诱导法用于疏水性药物，采用壳聚糖离子诱导法制备疏水性药物金雀异黄素纳米粒子乳液，以三聚磷酸钠为离子交联剂对其进行物理交联、包覆，制备金雀异黄素纳米粒子，并对其载药率和包裹率、释放性能进行了探讨。

1材料与方法

1.1试验试剂与仪器

试剂：壳聚糖（CS，AR，国药集团化学试剂有限公司），冰醋酸（AR，国药集团化学试剂有限公司），金雀异黄素（原药，纯度>99%，上海融合医药科技发展有限公司），聚乙二醇400（PEG400，CP，国药集团化学试剂有限公司），三聚磷酸钠（TPP，AR，国药集团化学试剂有限公司），二次蒸馏水。

仪器：透射电子显微镜（TECNAI 12 Philip Apparatus Co.，USA），紫外-可见分光光度计（UV-2550，日本岛津公司），傅里叶红外光谱仪（Tensor27，德国BRUKER公司），粒径分布仪（ZEN3690，英国Malvern公司），恒温槽（DK-S22，上海精宏实验设备有限公司）。

1.2试验方法

1.2.1金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的制备采用离子诱导法制备金雀异黄素纳米粒子，称取适量壳聚糖溶于醋酸中，调节pH值，获得壳聚糖醋酸溶液。将三聚磷酸钠水溶液与含有金雀异黄素的PEG400水溶液混合后，缓慢加入到壳聚糖醋酸溶液中，搅拌反应1 h，即可得金雀异黄素纳米粒子乳液。考察壳聚糖与三聚磷酸钠的质量比、体系pH值和PEG400的浓度对所获得的纳米粒子的粒径、载药率及药物包裹率的影响，筛选最佳制备工艺条件。

1.2.2金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的形貌表征通过透射电子显微镜观察与分析，可获得金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的形貌、大小及分布。

1.2.3金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的成分分析用傅里叶红外光谱仪对金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的成分进行分析、测定。

1.2.4包裹率及载药率的测定包裹率和载药率是评价粒子好坏的重要指标之一，包裹率和载药率经计算而得。

包裹率B=实际药物质量/理论药物质量×100%（1）

载药率Z=药物质量/药物微粒的质量×100%（2）

1.2.5金雀异黄素纳米粒子体外释放性能测定采用透析法考察金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的体外释放性能。金雀异黄素为疏水性药物，选择40%乙醇PBS缓冲溶液为释放介质，将金雀异黄素对照品和金雀异黄素壳聚糖纳米粒子分别装入处理过的透析袋中，加入20 mL释放介质，将透析袋置于装有200 mL 释放介质中，在37 ℃恒温水浴中旋转搅拌，定时取样5 mL，并同时补充等量的释放介质。样液使用紫外分光光度法测定金雀异黄素含量，并计算累积药物释放量。

2结果与分析

2.1金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的制备与表征

2.1.1金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的粒径分布图1为金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的粒径（Rh）分布图，在制备工艺的筛选中，纳米粒子粒径大小是重要的影响因素之一。由图1可知，该粒径分布范围在100～350 nm，平均粒径大小约为200 nm。

2.1.2CS/TPP质量比对金雀异黄素壳聚糖纳米粒子粒径和包裹率、载药率的影响图2、图3分别为CS/TPP质量比对纳米粒子粒径和包裹率、载药率的影响。从图2可以看出，当质量比m（CS）/m（TPP）为4～6时，粒径在200～300 nm范围，明显低于m（CS）/m（TPP）为3时的微米级粒径。图3表明，质量比m（CS）/m（TPP）与药物包裹率和载药率成反比，当质量比为3时包裹率和载药率为最大，分别为44.5%和111%，但此时粒径也最大，达微米级；当质量比为4时，粒径在200 nm左右且包裹率和载药率分别为38.5%和9.6%，因此，选择m（CS）/m（TPP）为4比较合适。

2.1.3pH值对金雀异黄素壳聚糖纳米粒子粒径和包裹率、载药率的影响图4、图5分别为体系pH值对纳米粒子粒径和包裹率、载药率的影响。从图4可见，纳米粒子的平均粒径与体系pH值成正比关系，pH值为2～4时，粒径在200～300 nm之间；当pH值为5～6时，粒子粒径在700～800 nm之间。从图5可以看出，粒子的包裹率和载药率随体系pH值增大出现缓慢下降的趋势，这是由于随着pH值增大，壳聚糖溶液中带正电荷的离子减少，在三聚磷酸钠中负电荷一定的情况下正电荷与负电荷之间的作用力就相应减弱，药物的包裹率及载药率则相应下降。因此，试验时，通常选择体系pH值为3，这时制备粒子的包裹率及载药率最大，分别为37.1%和9.3%。

2.1.4PEG400浓度对金雀异黄素壳聚糖纳米粒粒径和包裹率、载药率的影响图6、图7分别为在CS与TPP质量比为 4 ∶1、壳聚糖溶液pH值为3的条件下，考察助溶剂PEG400浓度的改变对形成纳米粒子粒径和包裹率、载药率的影响。从图6可以看出，在C（PEG400）为0.49 mol/L时，粒径最大，为 500～600 nm；随着PEG400浓度的增大，纳米粒子的粒径减小，C（PEG400）为0.81 mol/L时粒径为200～300 nm。从图7可见，在C（PEG400）为0.81 mol/L时，包裹率和载药率达到最大；但随着PEG400浓度继续增大时，溶解金雀异黄素的PEG用量就会增加，使得溶解在水中的金雀异黄素的浓度减小，导致被包裹的药物量减少，包裹率和载药率就会相应下降，因此，试验时选择C（PEG400）为0.8 mol/L。

综上分析，制备金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的最佳条件是m（CS）/m（TPP）为4∶1、体系pH值为3、C（PEG400）为 0.8 mol/L、金雀异黄素用量为10 mg。最佳工艺制备的金雀

异黄素壳聚糖纳米粒子的包裹率和载药率分别为37.1%和9.3%。

2.1.5金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的红外光谱特征通过金雀异黄素壳聚糖纳米粒子、金雀异黄素和壳聚糖的红外光谱（图8），可以看出在3 400 cm-1附近有较大的吸收峰，在800～1 750 cm-1附近出现了较多的吸收峰。不难看出，纳米粒子的红外光谱是壳聚糖和金雀异黄素红外图谱的叠加，但峰强度又较之强很多，这是因为金雀异黄素较少吸附在粒子表面，而被一起包裹在壳聚糖内部，并且相对含量较少。

2.1.6金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的形貌特征图9为金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的透射电镜图。由图9可见，纳米粒子呈圆球状，形状较规整，粒径分布在200～300 nm左右；粒子中间黑色部分为包裹的金雀异黄素，外围淡黑色部分为壳聚糖与三聚磷酸钠交联形成的壁壳。

2.2金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的体外释放特征

图10和图11分别为金雀异黄素对照品和金雀异黄素纳米粒子的体外释放曲线。从图10可以看出，金雀异黄素对照品的体外释放几乎与释放时间呈线性关系，在7 h内释放量Q达到94.05%，之后的释放量Q保持不变，说明7 h内金雀异黄素对照品几乎释放完毕。图11是金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的体外释放曲线，可以看出在60 h之后的释放量Q达到96.07%，表明金雀异黄素壳聚糖纳米粒子具有明显的缓释效果。

3结论

采用壳聚糖离子诱导法制备了1种新的疏水性药物金雀异黄素纳米粒子，以三聚磷酸钠为离子交联剂对其进行交联包裹形成纳米粒子，该法条件温和、工艺简单，克服了使用醛类交联剂和有机溶剂带来的毒性；壳聚糖是无毒无害可生物降解的天然高分子，可以增加药物对生物膜的通透性；三聚磷酸钠是一种食品中常用的添加剂，在人体内有较好的生物降解性。根据条件的考察确定制备金雀异黄素纳米粒子的最佳工艺是在室温条件下，壳聚糖与三聚磷酸钠质量比为 4 ∶1、体系pH值为3、PEG400浓度为0.8 mol/L、金雀异黄素用量为10 mg时，制备出的纳米粒子粒径为200～300 nm，药物包裹率和载药率分别为37.1%和9.3%，且药物的结构和性质没有发生变化；释放性能试验表明，该法制备的纳米粒子具有明显的缓释效果。这为疏水性药物金雀异黄素纳米粒子的制备和缓释研究提供了1种新的方法。

参考文献：

[1]Kumar N B，Cantor A，Allen K，et al. The specific role of isoflavones on estrogen metabolism in premenopausal women[J]. Cancer，2002，94（4）：1166-1174.

[2]Yu Z L，Tang Y N，Hu D S，et al. Inhibitory effect of genistein on mouse colon cancer MC-26 cells involved TGFI/Smad pathway[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2005，333（3）：827-832.

[3]Prabaharan M，Mano J F. Chitosan-based particles as controlled drug delivery systems[J]. Drug Delivery，2005，12（1）：41-57.

[4]Shu X Z，Zhu K J. Controlled drug release properties of ionically cross-linked chitosan beads：the influence of anion structure[J]. International Journal of Pharmaceutics，2002，233（1/2）：217-225.

[5]Prego C，Torres D，Fernandez-Megia E，et al. Chitosan-PEG nanocapsules as new carriers for oral peptide delivery：Effect of chitosan pegylation degree[J]. Journal of Controlled Release，2006，111（3）：299-308.

[6]Kim J H，Kim Y S，Park K，et al. Antitumor efficacy of cisplatin-loaded glycol chitosan nanoparticles in tumor-bearing mice[J]. Journal of Controlled Release，2008，127（1）：41-49.

[7]Gan Q，Wang T，Cochrane C，et al. Modulation of surface charge，particle size and morphological properties of chitosan-TPP nanoparticles intended for gene delivery[J]. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces，2005，44（2/3）：65-73.

2.1.3pH值对金雀异黄素壳聚糖纳米粒子粒径和包裹率、载药率的影响图4、图5分别为体系pH值对纳米粒子粒径和包裹率、载药率的影响。从图4可见，纳米粒子的平均粒径与体系pH值成正比关系，pH值为2～4时，粒径在200～300 nm之间；当pH值为5～6时，粒子粒径在700～800 nm之间。从图5可以看出，粒子的包裹率和载药率随体系pH值增大出现缓慢下降的趋势，这是由于随着pH值增大，壳聚糖溶液中带正电荷的离子减少，在三聚磷酸钠中负电荷一定的情况下正电荷与负电荷之间的作用力就相应减弱，药物的包裹率及载药率则相应下降。因此，试验时，通常选择体系pH值为3，这时制备粒子的包裹率及载药率最大，分别为37.1%和9.3%。

2.1.4PEG400浓度对金雀异黄素壳聚糖纳米粒粒径和包裹率、载药率的影响图6、图7分别为在CS与TPP质量比为 4 ∶1、壳聚糖溶液pH值为3的条件下，考察助溶剂PEG400浓度的改变对形成纳米粒子粒径和包裹率、载药率的影响。从图6可以看出，在C（PEG400）为0.49 mol/L时，粒径最大，为 500～600 nm；随着PEG400浓度的增大，纳米粒子的粒径减小，C（PEG400）为0.81 mol/L时粒径为200～300 nm。从图7可见，在C（PEG400）为0.81 mol/L时，包裹率和载药率达到最大；但随着PEG400浓度继续增大时，溶解金雀异黄素的PEG用量就会增加，使得溶解在水中的金雀异黄素的浓度减小，导致被包裹的药物量减少，包裹率和载药率就会相应下降，因此，试验时选择C（PEG400）为0.8 mol/L。

综上分析，制备金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的最佳条件是m（CS）/m（TPP）为4∶1、体系pH值为3、C（PEG400）为 0.8 mol/L、金雀异黄素用量为10 mg。最佳工艺制备的金雀

异黄素壳聚糖纳米粒子的包裹率和载药率分别为37.1%和9.3%。

2.1.5金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的红外光谱特征通过金雀异黄素壳聚糖纳米粒子、金雀异黄素和壳聚糖的红外光谱（图8），可以看出在3 400 cm-1附近有较大的吸收峰，在800～1 750 cm-1附近出现了较多的吸收峰。不难看出，纳米粒子的红外光谱是壳聚糖和金雀异黄素红外图谱的叠加，但峰强度又较之强很多，这是因为金雀异黄素较少吸附在粒子表面，而被一起包裹在壳聚糖内部，并且相对含量较少。

2.1.6金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的形貌特征图9为金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的透射电镜图。由图9可见，纳米粒子呈圆球状，形状较规整，粒径分布在200～300 nm左右；粒子中间黑色部分为包裹的金雀异黄素，外围淡黑色部分为壳聚糖与三聚磷酸钠交联形成的壁壳。

2.2金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的体外释放特征

图10和图11分别为金雀异黄素对照品和金雀异黄素纳米粒子的体外释放曲线。从图10可以看出，金雀异黄素对照品的体外释放几乎与释放时间呈线性关系，在7 h内释放量Q达到94.05%，之后的释放量Q保持不变，说明7 h内金雀异黄素对照品几乎释放完毕。图11是金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的体外释放曲线，可以看出在60 h之后的释放量Q达到96.07%，表明金雀异黄素壳聚糖纳米粒子具有明显的缓释效果。

3结论

采用壳聚糖离子诱导法制备了1种新的疏水性药物金雀异黄素纳米粒子，以三聚磷酸钠为离子交联剂对其进行交联包裹形成纳米粒子，该法条件温和、工艺简单，克服了使用醛类交联剂和有机溶剂带来的毒性；壳聚糖是无毒无害可生物降解的天然高分子，可以增加药物对生物膜的通透性；三聚磷酸钠是一种食品中常用的添加剂，在人体内有较好的生物降解性。根据条件的考察确定制备金雀异黄素纳米粒子的最佳工艺是在室温条件下，壳聚糖与三聚磷酸钠质量比为 4 ∶1、体系pH值为3、PEG400浓度为0.8 mol/L、金雀异黄素用量为10 mg时，制备出的纳米粒子粒径为200～300 nm，药物包裹率和载药率分别为37.1%和9.3%，且药物的结构和性质没有发生变化；释放性能试验表明，该法制备的纳米粒子具有明显的缓释效果。这为疏水性药物金雀异黄素纳米粒子的制备和缓释研究提供了1种新的方法。

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[7]Gan Q，Wang T，Cochrane C，et al. Modulation of surface charge，particle size and morphological properties of chitosan-TPP nanoparticles intended for gene delivery[J]. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces，2005，44（2/3）：65-73.

2.1.3pH值对金雀异黄素壳聚糖纳米粒子粒径和包裹率、载药率的影响图4、图5分别为体系pH值对纳米粒子粒径和包裹率、载药率的影响。从图4可见，纳米粒子的平均粒径与体系pH值成正比关系，pH值为2～4时，粒径在200～300 nm之间；当pH值为5～6时，粒子粒径在700～800 nm之间。从图5可以看出，粒子的包裹率和载药率随体系pH值增大出现缓慢下降的趋势，这是由于随着pH值增大，壳聚糖溶液中带正电荷的离子减少，在三聚磷酸钠中负电荷一定的情况下正电荷与负电荷之间的作用力就相应减弱，药物的包裹率及载药率则相应下降。因此，试验时，通常选择体系pH值为3，这时制备粒子的包裹率及载药率最大，分别为37.1%和9.3%。

2.1.4PEG400浓度对金雀异黄素壳聚糖纳米粒粒径和包裹率、载药率的影响图6、图7分别为在CS与TPP质量比为 4 ∶1、壳聚糖溶液pH值为3的条件下，考察助溶剂PEG400浓度的改变对形成纳米粒子粒径和包裹率、载药率的影响。从图6可以看出，在C（PEG400）为0.49 mol/L时，粒径最大，为 500～600 nm；随着PEG400浓度的增大，纳米粒子的粒径减小，C（PEG400）为0.81 mol/L时粒径为200～300 nm。从图7可见，在C（PEG400）为0.81 mol/L时，包裹率和载药率达到最大；但随着PEG400浓度继续增大时，溶解金雀异黄素的PEG用量就会增加，使得溶解在水中的金雀异黄素的浓度减小，导致被包裹的药物量减少，包裹率和载药率就会相应下降，因此，试验时选择C（PEG400）为0.8 mol/L。

综上分析，制备金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的最佳条件是m（CS）/m（TPP）为4∶1、体系pH值为3、C（PEG400）为 0.8 mol/L、金雀异黄素用量为10 mg。最佳工艺制备的金雀

异黄素壳聚糖纳米粒子的包裹率和载药率分别为37.1%和9.3%。

2.1.5金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的红外光谱特征通过金雀异黄素壳聚糖纳米粒子、金雀异黄素和壳聚糖的红外光谱（图8），可以看出在3 400 cm-1附近有较大的吸收峰，在800～1 750 cm-1附近出现了较多的吸收峰。不难看出，纳米粒子的红外光谱是壳聚糖和金雀异黄素红外图谱的叠加，但峰强度又较之强很多，这是因为金雀异黄素较少吸附在粒子表面，而被一起包裹在壳聚糖内部，并且相对含量较少。

2.1.6金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的形貌特征图9为金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的透射电镜图。由图9可见，纳米粒子呈圆球状，形状较规整，粒径分布在200～300 nm左右；粒子中间黑色部分为包裹的金雀异黄素，外围淡黑色部分为壳聚糖与三聚磷酸钠交联形成的壁壳。

2.2金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的体外释放特征

图10和图11分别为金雀异黄素对照品和金雀异黄素纳米粒子的体外释放曲线。从图10可以看出，金雀异黄素对照品的体外释放几乎与释放时间呈线性关系，在7 h内释放量Q达到94.05%，之后的释放量Q保持不变，说明7 h内金雀异黄素对照品几乎释放完毕。图11是金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的体外释放曲线，可以看出在60 h之后的释放量Q达到96.07%，表明金雀异黄素壳聚糖纳米粒子具有明显的缓释效果。

3结论

采用壳聚糖离子诱导法制备了1种新的疏水性药物金雀异黄素纳米粒子，以三聚磷酸钠为离子交联剂对其进行交联包裹形成纳米粒子，该法条件温和、工艺简单，克服了使用醛类交联剂和有机溶剂带来的毒性；壳聚糖是无毒无害可生物降解的天然高分子，可以增加药物对生物膜的通透性；三聚磷酸钠是一种食品中常用的添加剂，在人体内有较好的生物降解性。根据条件的考察确定制备金雀异黄素纳米粒子的最佳工艺是在室温条件下，壳聚糖与三聚磷酸钠质量比为 4 ∶1、体系pH值为3、PEG400浓度为0.8 mol/L、金雀异黄素用量为10 mg时，制备出的纳米粒子粒径为200～300 nm，药物包裹率和载药率分别为37.1%和9.3%，且药物的结构和性质没有发生变化；释放性能试验表明，该法制备的纳米粒子具有明显的缓释效果。这为疏水性药物金雀异黄素纳米粒子的制备和缓释研究提供了1种新的方法。

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[7]Gan Q，Wang T，Cochrane C，et al. Modulation of surface charge，particle size and morphological properties of chitosan-TPP nanoparticles intended for gene delivery[J]. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces，2005，44（2/3）：65-73.