超高压辅助物理法提取绿豆活性蛋白的研究

田海娟，王维坚，*，张亚楠

（1.吉林工商学院食品工程学院，吉林长春130062；2.粮油食品深加工吉林省高等学校重点实验室，吉林长春130062；3.北京古船油脂有限责任公司，北京100076）

超高压辅助物理法提取绿豆活性蛋白的研究

田海娟1，2，王维坚1，2，*，张亚楠3

（1.吉林工商学院食品工程学院，吉林长春130062；2.粮油食品深加工吉林省高等学校重点实验室，吉林长春130062；3.北京古船油脂有限责任公司，北京100076）

采用超高压技术提取绿豆活性蛋白，采用单因素试验与正交试验法对绿豆中活性蛋白的超高压提取工艺进行优选，绿豆活性蛋白提取率为指标，考察超高压压力、保压时间、固液比、提取温度对绿豆活性蛋白提取率的影响。结果显示，超高压压力300MPa、保压时间6min、提取温度40℃、固液比1∶15（g/mL），绿豆活性蛋白的提取率可达79.2%。试验结果表明，绿豆蛋白提取液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用。超高压提取方法得率高、提取时间短，是一种提取绿豆中活性蛋白的适宜方法。

超高压技术；绿豆活性蛋白；正交试验；提取率

绿豆，别名植豆、青小豆、吉豆。绿豆含有丰富的蛋白质、淀粉、维生素、人体必需的各种氨基酸和钙、铁等矿物质[1-2]。我国是绿豆生产大国、出口大国和消费大国[3]。我国绿豆年均种植面积近100万亩，年总产量达100万t以上；绿豆还是我国重要的出口商品，年出口原绿豆约2.0万t。目前，加工绿豆粉丝的传统工艺主要是针对提高绿豆淀粉的应用而设计的，其淀粉提取率低，而忽略了绿豆蛋白的开发与利用，把它作为废料或者牲畜饲料，从而造成绿豆蛋白资源浪费，研究表明，绿豆中蛋白质含量高达19.5%～33.1%，蛋白质功效比（PER）高（1.87），且氨基酸种类齐全，尤其以赖氨酸含量较为丰富，接近鸡蛋蛋白质赖氨酸含量。从应用价值来看，天然的绿豆蛋白具有明显的开发优势，绿豆蛋白具有优良的溶解性、乳化性和发泡性等功能特性，是作为蛋白补充剂和食品添加剂的绝好原料，在肉类产品和面制品中添加绿豆蛋白，不仅可改善食品的品质，还可增加食品的营养价值[4-5]。在食品加工业的面制品、肉制品、乳制品和饮料中的应用前景十分广阔。

超高压技术（ultra high pressure processing，UHP），又称为高静压技术，是一种以水或其他液体作为传压介质，对置于弹性密封容器内的食品进行100MPa以上高压处理的高新技术，具有杀菌、钝酶、辅助浸提和改善食品功能特性等作用[6]。国内外学者己先后开展了超高压技术在食品的杀菌与贮藏保鲜，果酱、果汁、肉制品、水产品的加工，食品物性和酒类品质的改良等方面的研究与应用开发工作[7]，并取得了较好的效果。本实验采用廉价的水作为提取剂，并利用超高压技术，通过调节压力、固液比、保压时间和提取温度而得到提取率高的绿豆活性蛋白提取液。该方法对水进行循环利用，缩短提取时间，降低能耗，降低生产成本，无污水排放，避免环境污染。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

绿豆；牛肉膏；蛋白胨；蒸馏水；大肠杆菌；金黄色葡萄球菌；灭菌锅；打孔器；培养箱；浆渣分离K600（3205）；胶体磨802-2型；离心机；DFZ-系列低温粉碎机：江阴市益江药华机械有限公司，凯氏定氮仪KDY-9830，100目筛；冰箱；超高冷等静压机HPB-A2（天津市华泰森淼生物工程技术有限公司；pHS-3C精密pH计：上海雷磁仪器厂；LPG-25高速离心喷雾干燥器：常州翔波机械制造厂；其他实验玻璃仪器。

1.2 方法

1.2.1 提取工艺

绿豆→常温加水浸泡12 h[8]→加水研磨，反复磨3次→超高压处理→过滤（100目筛）→离心（3000 r/min，5min）→绿豆蛋白提取液

1.2.2 超高压提取绿豆活性蛋白

称取一定量的绿豆浆渣[9]，加入不同体积的蒸馏水，混合成悬浊液；装入聚乙烯塑料袋，真空包装，包装后浸泡于高压容器的传压介质油中，高压处理悬浊液，再用100目筛过滤，去除固体颗粒后，离心取上清液获得提取液，提取3次，合并提取液，减压浓缩，计算绿豆活性蛋白提取率。

1.2.3 蛋白质测定方法

凯式定氮法（GB/T 5009.5-2003《食品中蛋白质的测定》）。

1.2.4 绿豆活性蛋白提取率的确定

准确称取绿豆m（g），依据凯式定氮法计算绿豆中的蛋白质含量X（g/100 g）；在最佳工艺条件下进行提取绿豆蛋白，测得提取液体积为V（mL），其中含蛋白质为C（g/mL），经计算绿豆活性蛋白得率为：

1.2.5 绿豆活性蛋白的抑菌性测定

1.2.5.1 培养基的制备

牛肉膏0.5 g；蛋白胨1 g；氯化钠0.5 g；琼脂2 g；蒸馏水100mL；pH7.0～7.2；灭菌105℃，25min。

1.2.5.2 供试菌株悬浮液的制备

分别挑选预先进行菌种斜面活化的金黄色葡萄菌种和大肠杆菌制成菌悬液，然后分别用无菌水稀释五个浓度梯度，使其含菌体为107CFU/mL~108CFU/mL，即得供试菌种。将各种菌的菌悬液贴好标签备用。

1.2.5.3 抑菌试液的制备

绿豆蛋白提取液用灭菌双蒸水按1∶5稀释，充分混匀，得1.0 g/mL原液。每种提取液分别贴好标签备用。

1.2.5.4 打孔法

在各平皿内分别加0.1mL菌悬液，用特制玻璃棒将菌液涂布均匀，每皿加入20mL培养基，再用打孔器在各皿中打5个直径为5mm圆孔，每孔相隔一定距离，以防止其相互影响，再用少量未冷却的培养基填封孔底，冷却后，每孔加入不同提取液并做标记，其中中间的圆孔加入0.1mL生理盐水做空白对照，每种提取液重复2个皿。最后，37℃恒温箱中培养24 h，测定抑菌圈大小。

1.2.5.5 纸片法

在各平皿内分别加0.1mL菌悬液，用特制玻璃棒将菌液涂布均匀，每皿加入20mL培养基，待培养基凝固后，用镊子夹取直径为1 cm的滤纸片蘸取不同浓度的提取液，编号1、2、3、4号，5号放置蘸取生理盐水的滤纸片做空白对照，每种提取液重复2个皿。最后，37℃恒温箱中培养24 h，测定抑菌圈大小。

2 结果与讨论

2.1 单因素对提取绿豆蛋白质的影响

2.1.1 压力对绿豆蛋白质提取率的影响

高压能破坏植物的细胞壁和胞内膜，压力是影响超高压提取的主要因素。高压能使提取溶剂与细胞的各组分充分接触，以达到快速提取的目的。试验分别采用150、200、250、300、350、400MPa超高压处理，保压时间为6min，固液比1∶15（g/mL），提取温度为40℃，连续提取3次，合并浸提液，用凯式定氮仪测定出提取液中蛋白质含量，计算出提取率，结果见图1。

图1 压力对绿豆蛋白提取率的影响Fig.1 Protein extraction rateofm ung bean under different pressure

由图1可知，压力在150MPa～300MPa之间，绿豆活性蛋白提取率随压力的增加而提高；压力高于300MPa，提取率变化缓慢。超高压提取是先对物料加压，保持一定时间后，然后急速泄压，造成细胞内外的压力梯度剧增，从而使细胞中的内含物释放出来。若大于300MPa时，细胞被破坏，绿豆活性蛋白提取率变化趋于平缓。因此选用250、300、350MPa作为正交试验中压力的3个水平。

2.1.2 固液比对提取蛋白质提取率的影响

将绿豆浆渣在300MPa，保压时间为6min，提取温度为40℃，固液比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25条件下，连续提取3次，合并提取液，计算出提取率，结果见图2。

图2 固液比对提取率的影响Fig.2 Protein extraction rateofm ung bean under different ratio of solid to liquid

由图2可知，固液比为1∶5～1∶25范围内时，随着加入的提取溶剂量的增加，提取液中绿豆活性蛋白的提取率也增加，当固液比达到1∶15后，绿豆活性蛋白提取率增加缓慢。在实际生产中，提取溶剂添加比例高，不仅消耗大量的溶剂，而且也降低了提取液中有效成分的浓度，在下一步的分离纯化过程耗能提高。由此，从单因素试验结果分析，并与实际生产相结合考虑，固液比为1∶15左右提取效果较好。因此，正交试验中选择固液比1∶10、1∶15、1∶20作为三个水平。

2.1.3 提取温度对绿豆蛋白提取率的影响

分别在不同温度情况下，将绿豆浆渣以300MPa高压处理6min，固液比1∶15（g/mL），连续提取3次，合并提取液，依据1.2.4计算公式得到绿豆蛋白的提取率，结果见图3。

图3 温度对绿豆蛋白提取率的影响Fig.3 Protein extraction rateofmung bean under different temperature

由图3可知，随着提取温度逐渐升高，绿豆活性蛋白质提取率也随之增高，当温度达到40℃时绿豆蛋白的提取率达到最高；温度继续升高，绿豆蛋白的提取率随之下降，温度从40℃提高到50℃，提取率下降比较显著；温度大于50℃，绿豆蛋白的提取率下降趋于缓慢。温度高有利于蛋白质溶解，蛋白质的提取率较高，但温度过高也会引起蛋白质变性而使提取率降低。因此，选择提取温度为40℃左右较适宜。正交试验选择30、40、50℃作为中温度的3个水平。

2.1.4 保压时间对绿豆蛋白质提取率的影响

分别将绿豆浆渣以固液比为1∶15（g/mL），提取温度为40℃，300 MPa高压，处理时间为2、4、6、8、10min，连续提取3次，合并提取液，依据1.2.4计算公式计算其提取率，结果见图4。

图4 保压时间对绿豆蛋白提取率的影响Fig.4 Protein extraction rateofmung bean under different holding time

由图4可知，保压时间在6min以内，绿豆活性蛋白提取率随时间增加而增加，超过6min后，随着保压时间的延长，绿豆活性蛋白提取率变化趋于平缓，变化不明显。这与高压对绿豆活性蛋白提取率的影响一致，保压时间的6min内处理，细胞的细胞壁和细胞膜逐步被破坏，超过6min，细胞被破坏，时间对绿豆活性蛋白提取率的影响就不显著。正交试验选择4、6、8min作为保压时间的3个水平。

2.2 提取工艺条件的优化

依据单因素的结果，设计L9（34）四因素三水平正交优化试验，以绿豆活性蛋白提取率为指标，每个试验重复两次，考察压力、固液比、保压时间及提取温度对绿豆活性蛋白提取率的影响，因素与水平的设计见表1。正交试验结果见表2。

表1 正交因素水平表Table1 Orthogonal factors level tab le

表2 正交试验结果Table2 The resu ltsof orthogonal test

通过极差分析可得，各因素对蛋白提取率影响的主次顺序为：D＞C＞A＞B，即提取温度＞保压时间＞压力＞固液比。根据平均值k1、k2、k3和极差R确定最优组合是A2B3C2D2，即压力300MPa、固液比1∶10、保压时间6min、提取温度40℃，绿豆活性蛋白提取率可达79.2%。经重复试验验证，该方案可行，能适用于实际运用中。

2.3 抑菌试验分析

通过打孔试验和纸片法试验对照结果表3与表4所示。

表3 打孔法测得抑菌圈的平均直径Table3 Theaverage diameter of bacteriostatic ring by punching method cm

表4 滤纸片法测得抑菌圈的直径Table4 Theaveragediameter of bacteriostatic ring by filter method cm

通过打孔法和纸片法对比结果显示，生理盐水对两种菌种均无抑菌作用，而绿豆蛋白提取液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用，且提取液的浓度越高抑菌作用越明显，其对大肠杆菌的抑制作用更明显。

3 结论

通过对压力、固液比、保压时间、提取温度的单因素实验和正交试验，得到超高压辅助物理法提取绿豆活性蛋白的最佳工艺条件为压力300MPa、保压时间6min、固液比1∶15、提取温度为40℃，绿豆活性蛋白提取率可达79.2%，且所提取的绿豆活性蛋白对金黄色葡萄球菌具有抑菌作用。超高压提取绿豆活性蛋白，时间短、提取率高。

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Research on Extraction of M ung Bean Active Protein by Ultra High Pressure-assisted Physical M ethod

TIANHai-juan1，2，WANGWei-jian1，2，*，ZHANGYa-nan3

（1.Branch of Food Engineering，Jilin Business and Technology College，Changchun 130062，Jilin，China；2.Key Laboratory of Grain and Oil Processing of Jilin province，Jilin Business and Technology College，Changchun 130062，Jilin，China；3.Beijing GuChuan Edible Oil CO.，Ltd.，Beijing 100076，China）

To optimize technique conditionsofultra high pressure-assisted extraction forMung bean protein，in order to improve Mung bean protein.Withmung bean protein extraction rate as indicators，single-factormethod wasused tooptimize the techniqueparameters.On thebasisofsingle-factorexperiment，L9（34）Orthogonalexperimentwasused to furtheroptimize the technique parameters．The resultsshowed that theoptimum extraction parameterswereultrahigh pressure 300MPa，theholding time6min，solid-liquid radio1∶15（g/mL），extraction temperature40℃.Theextraction rateofproteinoptimized byorthogonaltestwas79.2%.Experimentsasloproved thatthemungbean protein inhibitted thegrowthof Escherichiacoli and Staphylococcusaureus.The techniqueparametersofultrahigh pressure-assisted extraction forMungbean protein are rapid，scientific and effective.

ultrahigh pressure technology；mungbean protein；orthogonal test；extraction ratio

2014-02-08

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.23.004

吉林省教育厅项目（吉教科合字[2010]第226号）

田海娟（1980—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：农产品加工与资源利用。

*通信作者：王维坚（1967—），女，教授，硕士，研究方向：粮油食品。