佳西热带雨林土壤芽胞杆菌分离与多样性分析

张福特， 黄惠琴， 崔 莹， 孙前光， 朱 军， 刘 敏， 鲍时翔*

(1.海南大学 环境与植物保护学院，海南 海口 570228；2.中国热带农业科学院 热带生物技术研究所，海南 海口 571101)

佳西热带雨林土壤芽胞杆菌分离与多样性分析

张福特1,2， 黄惠琴2， 崔 莹2， 孙前光2， 朱 军2， 刘 敏2， 鲍时翔2*

(1.海南大学 环境与植物保护学院，海南 海口 570228；2.中国热带农业科学院 热带生物技术研究所，海南 海口 571101)

采用热处理法从海南省佳西热带雨林土壤中分离到147株芽胞杆菌，并利用16S rDNA PCR -RFLP与序列分析技术对其遗传多样性进行了研究。16S rDNA PCR -RFLP酶切图谱UPGMA聚类分析结果表明，在100%的相似性水平上，这些芽胞杆菌分属13个遗传类群。不同遗传类型代表菌株的16S rRNA基因序列分析结果显示，它们分布在Bacillaceae、Planococcaceae和Paenibacillaceae科的Bacillus、Lysinibacillus、Paucisalibacillus、Bhargavaea和Paenibacillus五个属，其中Bacillus为优势属(占50%)；有3株芽胞杆菌的16S rRNA基因序列与数据库中相应模式菌株的最大相似性在98.3%～98.9%之间。结果表明，佳西热带雨林土壤中芽胞杆菌有着较为丰富的遗传多样性。

热带雨林；多样性；16S rDNA PCR-RFLP；系统发育分析

海南是我国唯一的热带海岛省份，几乎集中了我国热带雨林的各种特点，分布着国内绝大部分的热带植物、动物和微生物[1]。佳西热带雨林自然保护区位于海南岛西南部(109°96′～10°99′E，19°62′～19°67′N)，自然环境优越，雨水充沛，阳光充足，植物覆盖率高，土壤腐殖质较高，芽胞杆菌是其土壤区系中常见的细菌类群[2 -3]。芽胞杆菌在工农业、医药卫生、环保等领域有着广泛的用途，可用于处理工业废水和降解原油、降解土壤中的难溶化合物、防治植物病虫害以及农业废弃物降解等[4]。本文从佳西热带雨林土壤中分离芽胞杆菌，并对其遗传多样性及系统发育关系进行研究，为热带雨林芽胞杆菌资源的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 样品的采集 采用5点法从海南岛佳西热带雨林(109°10′～109°12′E，18°52′～18°53′N)采集5～10 cm深的土壤样品，混合均匀后，置于无菌采样袋中，及时带回实验室处理。其余样品置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.1.2 芽胞杆菌分离培养基(g/L) 营养琼脂培养基：牛肉膏3，蛋白胨10，氯化钠5，琼脂粉18，pH 7.5；麦芽汁营养琼脂培养基：将麦芽汁琼脂培养基(波美度为7°)与营养琼脂培养基分别灭菌，冷却至55 ℃时以1∶ 1的比例混合；SYD培养基：可溶性淀粉3，蛋白胨10，酵母膏3，葡萄糖3.5，KH2PO41.5，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.1，NaCl 5，琼脂粉18，pH 7.5。所有培养基均用蒸馏水溶解配制，1×105Pa灭菌20 min，倒平板备用。

1.2方法

1.2.1 芽胞杆菌的分离 处理方法：取经研磨的土壤样品10 g，放入盛有90 mL无菌蒸馏水的三角瓶中，置于30 ℃、200 r/min的恒温摇床中振荡30 min，使土块混匀。配制成稀释梯度为10-1～10-4的土壤悬液，80 ℃水浴处理15 min后，取0.1 mL涂布。根据菌落形状、颜色、边缘状态、透明度、表面干湿状态等表型特征，挑取不同的单菌落划线，获得纯培养。选取菌落表型不同的菌株，采用郑平的方法[5]进行芽胞染色验证后，进行编号、保存。

1.2.2 16S rDNA PCR-RFLP分析 基因组DNA提取参照文献[6]进行。选用16S rRNA基因序列保守区域的2段引物扩增16S rDNA：P1(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′)；P6(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′)。引物由上海生工生物技术有限公司合成。PCR反应程序：95 ℃ 15 min；94 ℃ 1 min，58 ℃1 min，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min。选取限制性内切酶MspI(TaKaRa)酶切后，经3%的琼脂糖凝胶电泳得出酶切图谱。用NTSYS-pc2.01软件进行相似性分析，采用平均连锁法(UPGMA)聚类，得到菌株间的聚类关系[7]。

1.2.3 16S rRNA基因序列测定及其系统发育分析 从16S rDNA PCR-RFLP的不同遗传类型中，各选取1～2株代表菌株送上海生工生物工程有限公司测序。将16S rRNA基因测序结果在EzTaxon server 2.1和GenBank中进行Blast比对分析。采用MEGA 5.0软件中的邻位相连法(Neighbor-joining)和Kumura2-parameter矩阵模型构建系统发育树，自展数(bootstrap)设置为1000。

2 结果与分析

2.1佳西热带雨林土壤芽胞杆菌分离

通过稀释平板涂布法，从3种分离培养基中共得到147株芽胞杆菌，来源于营养琼脂培养基的37株、SYD培养基的45株、麦芽汁营养琼脂培养基的65株。在SYD分离培养基上生长的菌落，菌落形态的种类比较多；麦芽汁营养琼脂培养基上的芽胞杆菌菌落大小较为均匀和稳定，便于后期分离纯化。

2.2菌株的16SrDNAPCR-RFLP的多样性分析

图1 芽胞杆菌16S rDNA PCR-RFLP酶切图谱Fig.1 Macrorestriction map generated from16S rDNA PCR-RFLP of Bacillus-like species

每一个16S rRNA基因限制性片断长度多态性类型代表一种遗传类型。对147株芽胞杆菌的16S rRNA基因扩增产物(1 500 bp左右)使用限制性内切酶MspI进行酶切分型，通过147株芽胞杆菌的酶切图谱共划分为15种遗传型(图1，带型9和10一致，4和17一致)，其中以菌株DB13010为代表的酶切类型为优势型，占27.9%。

酶切图谱聚类分析结果见图2，以相似系数0.56为结合点时，佳西热带雨林土壤可培养芽胞杆菌可分为2大类群；以相似系数0.78为结合点，可分为6个类群；随着相似系数的增大，可培养芽胞杆菌的群落结构越复杂，在相似系数为1.0时，土壤可培养芽胞杆菌可分为13个类群。

图2 可培养芽胞杆菌16S rDNA PCR-RFLP聚类分析树状图Fig.2 Dendrogram generated from 16S rDNA PCR-RFLP of Bacillus-like species

2.3可培养芽胞杆菌16SrRNA基因序列测定及其系统发育分析

根据每个遗传类群所包含的菌株数量及其菌落形态特征，从13种遗传型中选出16株代表菌进行了16S rRNA基因序列的测定。将所得序列提交GenBank获得登录号，并在EzTaxon server 2.1和GenBank中进行Blast比对分析。结果显示，佳西热带雨林土壤可培养芽胞杆菌资源主要分布在Bacillaceae、Paenibacillaceae与Planococcaceae三科。其中，Bacillaceae科下包含Bacillus(占50%)、Lysinibacillus(占6%)、Paucisalibacillus(占6%)3个属，Bacillus为优势属；Paenibacillaceae科下Paenibacillus属(占32%)；Planococcaceae科下Bhargavaea属(占6%)。通过序列比对还发现，同源性为99.2%～99.9%的有9株；同源性100%有4株；菌株DB13018、DB13030和DB13031与相应模式种的序列最大同源性分别为98.9%、98.7%和98.3%，可能是芽胞杆菌新资源，为潜在的新分类单元[8]。

由图3得出各菌株间的系统进化关系，Bacillussp. DB13013和Bacillussp. DB13039与Bacillussp. DB13011在系统发育树上聚为一簇，进化距离较近；Bacillussp. DB13001、Bacillussp. DB13022、Bacillussp. DB13010和Bacillussp. DB13016在系统发育树上聚为一簇，它们均与各自同源性最高的模式菌株聚在一起；菌株DB13023与前述的7株芽胞杆菌有着共同的进化起点，在系统发育树上与它们同聚在一个大的分支；菌株DB13020和DB13026均与各自同源性最高的模式菌株聚在一起，在系统发育树上单独成簇。菌株DB13030和DB13031在系统发育树上聚在一起，与PaenibacillusbarcinonensisBP-23T聚为一簇；3株类芽胞杆菌DB13027、DB13025和DB13036在系统发育树上聚为一簇，进化距离较近。Bhargavaeasp. DB13018与BhargavaeacecembensisDSE10T同源性最高，在系统发育树上聚为一簇。

图3 可培养芽胞杆菌基于16S rRNA基因的系统发育分析Fig.3 Phylogenetic tree of Bacillus-like species based on 16S rRNA gene sequences

3 讨 论

芽胞杆菌是土壤微生物的重要组成部分，在土壤生态系统中占有重要地位。受土壤条件、植物群落和气候条件等环境因子的影响，不同生境类和数量会存在一定差异[8]。本文首次对佳西热带雨林土壤的可培养芽胞杆菌资源进行了报道，研究表明，该生境土壤中存在着丰富的芽胞杆菌资源，其中芽胞杆菌属(Bacillus)为土壤芽胞杆菌中的优势类群，株的50%；崔莹等[99]研究尖峰岭热带雨林芽胞杆菌多样性分析发现，Bacillus也是主要优势菌属，说明在属的水平上，海南省两大热带雨林土壤中的可培养芽胞杆菌都以Bacillus为主要优势菌属。

DNA遗传多样性是微生物多样性研究的主要内容之一。16S rDNA PCR-RFLP可快速将芽胞杆菌划分成不同的遗传型，但由于MspI酶切作用位点的限制，该方法并不足以揭示部分亲缘关系较近的芽胞杆菌间的遗传差异；仅通过16S rRNA基因的比对也不能完全反映菌株之间的遗传差异，如菌株DB13030与DB13031在16S rRNA基因系统发育树上处于同一分支(同源性99.0%)，但其酶切带型不一致。通过16S rDNA PCR-RFLP和16S rRNA基因序列分析2种方法的有效结合更能全面客观的反映出供试菌株的遗传多样性，同时也可对所得的遗传信息进行相互补充，能较快速、准确地检测土壤中的芽胞杆菌资源。

在进行菌株鉴定时，发现菌株DB13031和模式菌株PaenibacillusbarcinonensisBP-23T的16S rRNA基因同源性仅为98.3%，在发育树上处于同一分支，亲缘关系最近，二者DNA-DNA杂交值为38.1%。根据国际系统细菌学委员会(ICSB)规定，DNA同源性≥70%或杂交分子的热解链温度差≤2 ℃为细菌种的界限，因而鉴定菌株DB13031为类芽胞杆菌属(Paenibacillus)的一个新种，命名为Paenibacillusjiaxiensissp. nov.(另文发表)，佳西热带雨林中可能还存在着大量的芽胞杆菌新资源等待人们去发掘利用。Asha BM等[10-11]研究发现，P.barcinonensisBP-23T能产生木聚糖酶、内切葡聚糖酶、酯酶和嗜热纤维素酶等酶类。采用刚果红透明圈法[12]筛选纤维素酶活性时也发现，菌株DB13013、DB13023、DB13020、DB13039、DB13031和DB13030在培养3～4 d时能产生清晰的透明圈，Hc值1.80～5.14不等(Hc值为透明水解圈直径/菌落直径)，具有明显的产纤维素酶能力，这可能与菌株生存的高纤维热带雨林环境密切相关。

[1] 陈灵芝.中国的生物多样性现状及其保护对策[M].北京:科学出版社，1993．

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“烟草对常见口腔微生物生长影响的初步研究”作者信息更正

经本刊2014年第34卷第3期文章“烟草对常见口腔微生物生长影响的初步研究”第一作者季惠惠及第三作者王小林对作者信息确认，“王小琳”应为“王小林”。

IsolationandDiversityofBacillusSpeciesfromJiaxiTropicalRainForestSoil

ZHANG Fu-te1, 2, HUANG Hui-qin2, CUI Ying2, SUN Qian-guang2, ZHU Jun2, LIU Min2, BAO Shi-xiang2

(1.Coll.ofEnvironm't&PlantProtect'n,HainanUni.,Haikou570228; 2.Inst.ofTropicalBio-Sci. &Bio-Technol.,CATAS,Haikou571101)

147Bacillus-like strains were isolated fromJiaxitropical rain forest soil of Hainan using heat treatment method. The genetic diversity research was carried out with 16S rDNA PCR-RFLP and sequence analysis. At the level of 100% similarity, cluster analysis results of UPGMA of 16S rDNA PCR-RFLP enzyme digestion atlas showed that theseBacillusisolates belonged to 13 genetic groups. 16S rRNA gene sequence analysis of different genetic type of representative strains showed that they were distributed in five genera:Bacillus,Lysinibacillus,Paucisalibacillus,BhargavaeaandPaenibacillusof the families of Bacillaceae, Planococcaceae and Paenibacillaceae, andBacilluswas the dominant one (accounted for 50%). Based on the comparison of 16S rRNA gene sequences, the high levels of 16S rRNA gene similarities among them three strains with the corresponding type strains in the data base ranged from 98.3%～98.9%. The results showed that cultivableBacillus-like species from tropical rain forest soil possessed fairly rich genetic diversity.

tropical rain forest； diversity； 16S rDNA PCR-RFLP； phylogenetic analysis

公益性行业(农业)科研专项(201303094)；海南省重大科技项目(ZDZX2013023-1)；中央级公益性科研院所基金(1630052012002)

张福特 男，硕士研究生。主要从事微生物资源与应用研究。Tel:0898-66988564，E-mail:1142170459@qq.com

* 通讯作者。男，研究员，博士生导师。现从事微生物资源与应用研究。Tel:0898-66988564，E-mail:bsxitbb@163.com

2013-11-22；

2013-12-10

Q939.96;S154.3

A

1005-7021(2014)04-0042-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2014.04.008