乳腺癌RCL、TAOK1、14-3-3 zeta、ZNF706蛋白表达的临床病理意义

凌人，凌今，倪型灏，薛洪燕，施红旗，陈仲华

（1.金华广福肿瘤医院 病理科，浙江 金华 321001；2.复旦大学 药学院，上海 201203；3.浙江省肿瘤医院 病理科，浙江 杭州 310001；4.金华市人民医院 病理科，浙江 金华 321001；5.金华市中心医院 病理科，浙江 金华 321001）

乳腺癌是一种遗传异质性的恶性肿瘤，其发生发展是一个多因素多阶段的过程，往往涉及多个基因的改变[1]。以肿瘤生物学指标（包括ER、PR、HER2等）为依据的基因分型，不仅能够判断肿瘤的预后及转移，还能预测肿瘤对治疗的敏感性，并为肿瘤个体化治疗提供依据[2-3]。然而，乳腺癌相关的癌基因远不止这些，本研究通过对前期筛查与乳腺癌相关的4个新基因—RCL、TAOK1、14-3-3 zeta、ZNF706在乳腺癌中的表达情况进行检测、分析，旨在探讨这4个基因与乳腺癌临床特征的关系，为临床诊治提供新的参考。

1 资料和方法

1.1 一般资料 标本取自2008年1月-2011年12月间在金华广福肿瘤医院接受手术治疗的60例乳腺癌患者，均为女性，中位年龄53岁（38～82岁），术前均未做放化疗以及内分泌治疗，有完整的临床资料。研究对象确诊为浸润性导管癌，参照WHO乳腺肿瘤组织学分类，术后根据患者临床分期、病理分型进行化疗及辅助内分泌治疗，对于有淋巴结转移且直径5 cm以上者予以放疗。

1.2 主要试剂和仪器 兔抗人RCL、TAOK1、14-3-3 zeta、ZNF706一抗以及对应二抗均购自美国Abcam公司。抗体稀释工作液、DAB显色试剂盒购自Leica公司。免疫组织化学全自动染色仪为Leica公司的BOND-MAX。

1.3 实验方法

1.3.1 标本：取上述存档的石蜡包埋组织块，连续切片，每份标本行常规HE染色对照。

1.3.2 免疫组织化学染色：采用S-P法[4]，结合预实验确定的条件进行染色。石蜡组织切片脱蜡、水化后灭活内源性过氧化物酶，其中RCL、ZNF706组切片高压抗原热修复1 min，TAOK1、14-3-3 zeta组切片不修复，PBS溶液清洗，10%正常羊血清封闭30 min，倾去血清再滴加一抗（稀释度：RCL 1∶100，TAOK1 1∶200，14-3-3 zeta 1∶100，ZNF706 1∶200）室温下孵育120 min，二抗室温下孵育30 min，加入显色液显色。苏木素复染、脱水、分色、透明、中性树胶封片。免疫组织化学染色由Leica全自动免疫组织化学染色仪完成。

1.3.3 质量控制：①做好预实验，选择最佳免疫组织化学条件。②对照设置：以说明书指定的组织切片染色阳性片为阳性对照，以普通羊血清代替一抗为阴性对照。③判定程序：连续10个高倍镜视野下分别计数100个细胞，观察各抗体的细胞定位，以定位处出现棕黄色颗粒状染色为阳性表现，观察染色强度并计数染色比例。④免疫组织化学染色结果判读由2位病理科主治以上级别医师在双盲条件下独立完成，判读不一致时，经多镜头显微镜下讨论得出一致结论。

1.3.4 判定标准：根据2009年版乳腺癌HER2检测指南判定。强阳性染色（+++）：染色深，且染色细胞比例超过50%者；阳性染色（++）：染色强度中等，且染色细胞比例25%～50%者；弱阳性染色（+）：染色较浅，且染色细胞比例10%～25%者；阴性染色（-）：定位处没有染色，或者染色细胞比例＜10%者。

1.4 临床资料分类 乳腺癌病患分类分级采用国际抗癌联盟UICC和美国癌症联合委员会AJCC制定的TNM分期第6版方法。

1.5 统计学处理方法 采用SPSS 18.0统计学软件。计数资料采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组织化学染色结果 RCL表达为胞浆染色，镜下呈均匀一致细颗粒状，偶见胞膜胞核染色，呈灶性或多点散在分布。RCL在内对照中多为弱表达（+）或不表达（-），乳腺癌组织内表现为强表达（++～+++），见图1。总体强表达率为85%（51/60），其在癌组织与内对照中的表达差异具有统计学意义（P=0.001，见表1）。

TAOK1表达为胞浆着色，镜下呈均匀一致的棕黄色细颗粒状，偶见胞膜线性着色。TAOK1在内对照中多不表达（-），乳腺癌组织内表达强弱不等（+～+++），见图1。总体表达率为90%（54/60），其在癌组织与内对照中的表达差异具有统计学意义（P=0.001，见表1）。

14-3-3 zeta表达为胞浆着色，镜下呈均匀一致的棕黄色细颗粒状。TAOK1在内对照中多不表达（-），乳腺癌组织内表达强弱不等（+～+++），见图1。总体表达率为80%（48/60），其在癌组织与内对照中的表达差异具有统计学意义（P=0.001，见表1）。

ZNF706表达为胞核着色为主，偶见胞浆染色，染色中等到弱。ZNF706在内对照中多不表达（-），乳腺癌组织内表达强弱不等（+～+++），见图1。总体表达率为83%（50/60），其在癌组织与内对照中的表达差异具有统计学意义（P=0.001，见表1）。

图1 免疫组织化学法检测RCL、TAOK1、14-3-3 zeta、ZNF706的表达情况（低倍镜：×100，高倍镜：×400）

表1 RCL、TAOK1、14-3-3 zeta、ZNF706的基因蛋白表达与乳腺癌及癌旁组织表达比较（n=60）

2.2 4个新靶基因的表达与临床病理因素的相关性本研究进一步对RCL、TAOK1、14-3-3 zeta、ZNF706在乳腺癌组织中的表达情况与患者临床病理资料进行归类，通过对其表达情况与各临床病理因素的统计学分析得出：RCL的表达在不同肿瘤大小（P=0.012）、病理分级（P=0.044）之间差异有统计学意义（P＜0.05），与年龄、有无淋巴结转移无关（P＞0.05）；TAOK1、14-3-3 zeta的表达与年龄、肿瘤大小、病理分级、有无淋巴结转移均无关（P＞0.05）；ZNF706的表达与淋巴结转移（P=0.001）有关（P＜0.05），与年龄、肿块大小、病理分级无关（P＞0.05）。见表2。

2.3 4个新靶基因的表达与乳腺癌分子分型标志物的相关性 ER、PR、HER2、Ki67是乳腺癌分子分型的重要依据，本研究对样本标志物的表达与本课题研究的新基因表达进行了统计分析，结果显示：RCL的表达与Ki67高低[5]之间的差异有统计学意义（P=0.032），Ki67≥14组中RCL表达强阳性明显增多；TAOK1的表达与ER、HER2表达之间差异均有统计学意义（P=0.031、P=0.04），ER（-）组中TAOK1表达升高，在HER2（+）中表达亦增多；14-3-3 zeta和ZNF706的表达分别与ER的表达差异有统计学意义（P=0.01、P=0.038），在ER（+）组中14-3-3 zeta和ZNF706均呈高表达。见表3。

表2 RCL、TAOK1、14-3-3 zeta、ZNF706的蛋白表达与临床病理指标的关系

表3 RCL、TAOK1、14-3-3 zeta、ZNF706的表达与乳腺癌分子分型标志物的关系

3 讨论

随着肿瘤分子标志物研究的不断深入，越来越多的标志物被逐步发现，它们与肿瘤的发生发展有着密切的联系，其表达的改变在协助诊断疾病、指导临床治疗方面有着重要价值。近年来，除对乳腺癌进行传统的组织学分类以外，根据分子标志物表达的不同，还可以将其分为4个分子亚型：luminal A型、luminal B型、HER2型、基底样/三阴性乳腺癌[6]。临床上虽然对已分型的各个亚型制定了有针对性的治疗方案，然而，乳腺癌癌基因的研究仍不够透彻，导致亚型分类不完善，同亚型的患者预后和对药物的敏感性依然存在差异，这大大阻碍了乳腺癌个性化治疗的开展[7]。因此，探寻乳腺癌中新的分子标志物，更加科学地实施个性化诊疗显得意义重大。

目前，在乳腺癌中已发现多种成熟的分子标志物，包括HER2、ER、PR、Ki67等。其中HER2被认为是乳腺癌细胞增殖的驱动基因，其高表达往往提示不良预后。研究表明，在乳腺癌中HER2和ETV1可以协同上调RCL的表达[8]；同时RCL是C-MYC反应基因，其反应产物参与嘌呤或嘧啶补救合成、糖酵解和血管形成，因此与乳腺癌的进展高度相关[9]。在Oncomine数据库中，RCL表达在7个不同类型的肿瘤（淋巴瘤、结肠癌、脑肿瘤、肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、白血病）中表达上调，也同样表明RCL广泛参与肿瘤形成。本研究显示RCL在乳腺癌组织中显著高表达，且高表达组中肿瘤大小、病理分级、Ki67明显增大，提示RCL在乳腺癌分化、增殖进展中发挥重要作用。RCL的强表达提示乳腺癌分化低、恶性程度高，预后较差，其与肿瘤的转移并无明显相关性。本研究结果与先前的研究结果基本一致。然而在本研究中未发现RCL与HER2基因之间存在联系，这可能是由于RCL的强表达是由ETV1和HER2共同控制上调所引起的，具体机制需进一步深入研究。

有丝分裂元激活蛋白激酶（metogen-activated protein kinases，MAPK）通路是促进肿瘤发生发展的又一重要信号通路。MAPK可经Ras通路磷酸化激活，提高乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力。TAOK1处于p38MAPK上游，其可通过磷酸化MKK3进一步激活p38MAPK，调节核内转录因子，介导细胞增殖、分化、抑制凋亡[10]。本实验研究发现，TAOK1在乳腺癌组织中高表达，暗示其与乳腺癌之间存在联系。然而TAOK1与患者临床病理因素之间并无相关性，可能是由于本研究中样本量较少，或是TAOK1信号调控并不占据主要地位[11]。

14-3-3 zeta蛋白是细胞调控的又一重要信号分子，作用包括：抑制整个细胞周期进程，造成G1/S、G2/M阻滞；作用于多种细胞因子受体，参与信号转导及转录的调控；通过对MAPK、Bcl-2和凋亡相关激酶调控参与细胞凋亡过程[12]。有研究表明，14-3-3 zeta在多种癌症中高表达，若敲除人肺腺癌A549细胞的14-3-3 zeta基因，可以恢复癌细胞对失巢凋亡的敏感性，控制癌细胞生长，说明14-3-3 zeta高表达可以通过抑制凋亡来促进癌症进展。国外学者研究发现，14-3-3 zeta在乳腺癌中高表达与内分泌治疗的耐药相关，14-3-3 zeta高表达的患者在进行内分泌治疗后耐药率显著高于低表达组[13]。在本实验中，14-3-3 zeta在乳腺癌组织中显著高表达，然而统计发现其与临床病理因素无明显相关，推测其与肿瘤分化、进展无直接联系，不能提示预后。14-3-3 zeta在ER（+）组中表达显著高于ER（-）组，提示14-3-3 zeta在乳腺癌中的上调可能受到激素影响，进一步分析14-3-3 zeta（+）和ER（+）的患者内分泌治疗的预后可能会得到其与内分泌治疗抵抗的相关性结论，这将成为本课题组后续研究的一个方向。

ZNF706是一种结构蛋白，属于锌指蛋白家族中的成员，它与表观遗传以及核信号转录相关。国内外对于ZNF706的研究均较少，其具体功能未知。近期基因组学研究发现，ZNF706在胃癌和肝癌中的基因拷贝数和表达上调，这些结果提示ZNF706与癌症相关[14-15]。本课题对ZNF706在乳腺癌中的临床病理意义进行了初步探讨，发现ZNF706在内对照中表达少，而在乳腺癌组织中广泛表达，且统计发现表达与肿瘤转移、ER（+）有关，提示ZNF706与乳腺癌转移存在一定联系，可能成为新的乳腺癌转移风险评估的新指标。

综上所述，本实验对于乳腺癌组织中RCL、TAOK1、14-3-3 zeta、ZNF706蛋白表达情况进行了初步研究，这4种蛋白表达与乳腺癌密切相关，其中RCL、ZNF706分别与肿瘤大小、病理分级、有无淋巴结转移存在关联，对于乳腺癌的风险评估具有一定的临床意义。未来希望能深入论证这4种蛋白在乳腺癌发生发展中扮演的角色，为乳腺癌的预后评估、治疗的新方向提供理论依据。