白桦开花调控相关基因FLC、LFY和SOC1的克隆及表达分析

王子佳 姜 静 刘桂丰 刘菲菲 李慧玉

(林木遗传育种国家重点实验室 (东北林业大学)，黑龙江 哈尔滨 150040)

白桦开花调控相关基因FLC、LFY和SOC1的克隆及表达分析

王子佳 姜 静 刘桂丰 刘菲菲 李慧玉

(林木遗传育种国家重点实验室 (东北林业大学)，黑龙江 哈尔滨 150040)

为研究LFY、FLC及SOC1开花调控关键节点基因在白桦花时调控中的作用，从白桦转录组数据中获得了LFY和FLC的全长cDNA序列，分别命名为BpLFY和BpFLC。获得的BpLFY基因编码区长1 215 bp，编码405个氨基酸，分子量为45.3 kD。BpFLC基因cDNA编码区长627 bp，编码209个氨基酸，分子量为11.4 kD，这2个基因分别属于FLO-LFY和MADS超家族。对3个基因的启动子进行分析，发现3个基因启动子区均含有2个花粉特异表达的顺式作用元件。通过实时定量PCR对BpLFY、BpFLC及BpSOC1在白桦茎尖、叶片、雄花序和叶腋中表达模式的分析结果表明，BpSOC1和BpFLC在白桦各个组织部位均表达，而BpLFY只在雄花序和发育中的腋芽中表达，且在叶片中BpFLC可抑制BpSOC1的表达。

白桦；FLC；LFY；SOC1；启动子分析；基因表达

在植物的生长发育周期中，开花是被子植物最重要的发育过程[1]。MADS-box基因在显花植物花器官的分化、花时调节以及果实的发育与成熟等过程中均起着重要的调控作用。通过30多年的拟南芥遗传分析，目前已经得出了4条复杂的开花诱导调控途径：光周期途径、春化途径、自主途径以及赤霉素途径[2-4]。这4种途径通过对一些关键节点基因的控制，如FLC(FloweringLocusC)、LFY(LEAFY)、SOC1(SuppressorofOverexpressionofConstans1)等，从而调控植物开花过程[5-6]。FLC、SOC1是2个最重要的开花调控基因，除此之外的MADS-box基因和非MADS-box基因通过调节FLC和SOC1，影响植物开花时间。4条拟南芥(Arabidopsisthaliana)开花相关的调节途径中，FLC和CO(Constans)对SOC1表达的抑制和促进均是通过与其启动子区 (2个相邻的CArG基序列)的结合实现的，并且前者的结合会对后者与SOC1的结合产生阻碍。同时，SOC1 在茎顶端表达的编码产物能直接和AGL24结合，并激活LFY的表达，从而促进植物开花[1,5-6]。因此FLC、LFY、SOC1是植物成花过程中具有代表性的关键节点基因。

LFY与AP1基因通过ABC模型共同调控花器官生长发育。Yamaguchi等研究发现LFY基因可抑制花梗发育,通过花梗长度和方向(角度)影响花序结构的多样性[7]。近几年的研究中发现LFY与DNA结合具有促进腋分生组织生长的能力[8]。

白桦(BetulaplatyphyllaSuk.)是东北主要造林树种，花期为5月，果熟期7月，在前期研究中已克隆获得SOC1基因[9]。本研究成功克隆了重要的开花调控节点基因FLC和LFY，并研究了FLC、LFY、SOC1在不同组织中的时序表达，为深入了解林木成花分子机理，寻找关键基因提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试材取自东北林业大学林木遗传育种试验基地多年生已开花结实的白桦。由于白桦雌花在第1年的6月初开始雌花芽发育，并以花原基方式越冬，第2年早春(4月下旬)继续发育，成熟一般在5月初并在此阶段授粉；而雄花发育是在当年的6月开始，所以根据白桦花序发育过程特点，从6月末到8月中旬选取6月25日、7月10日、7月25日和8月10日4个时间点，分别摘取30株白桦茎尖、叶片、雄花序、腋芽混样， -80℃保存备用。

PrimeScript®RT-PCR Kit购自宝生物工程(大连)有限公司，BioEasy SYBR Green I Real Time PCR Kit购自TOYOBO，引物由上海生工生物技术服务公司合成。OPTICON 2实时荧光定量PCR仪(MJ Research®)上进行。

1.2 分析方法

1.2.1 白桦BpLFY和BpFLC基因的获得及序列分析 从白桦二倍体、四倍体、顶芽6个白桦转录组(未公布)中获得的Unigenes进行拼接得到全长序列，通过BLASTX和BLASTN比对分析对基因功能进行注释，最终获得全长LFY和FLC，命名为BpLFY，BpFLC。用NCBI ORF Finder 程序查找序列的ORF ；用ProtParam(http://au.expasy.org /tools/ protparam.html)计算蛋白分子的分子量以及理论PI；用BLASTP预测保守区；用软件MEGA 4.0进行多序列比对及系统发育进化树的构建。

1.2.2BpSOC1、BpLFY和BpFLC基因启动子分析 根据本实验室已经获得的白桦基因组数据(未公布)，获得了BpSOC1、BpLFY和BpFLC基因ORF区上游 2 000 bp的启动子序列。通过PLACE在线分析软件(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)对3个基因的启动子序列进行分析[10]。

1.2.3BpSOC1、BpLFY和BpFLC基因在不同组织部位的表达分析 采用CTAB法分别提取白桦茎尖、叶片、雄花序、腋芽的总RNA，并通过RNA的反转录获得cDNA序列，将之稀释10倍，-20℃保存，用于定量PCR。

根据3个节点基因的开放阅读框设计实时荧光定量PCR引物(表1)。以不同组织(茎尖、叶片、雄花序、腋芽)和时间(6月25日、7月10日、7月25日和8月10日)的白桦RNA为模板，分别扩增3个节点基因和2个内参基因α-tublin、18SrRNA，每个基因进行3次重复试验。实时定量PCR方法及体系参见文献[9]。使用Opticon Monitor 2.02分析扩增数据，并采用Duncan法和IBM SPSS Statistics 19软件对其进行统计分析。根据公式X=2-ΔΔCT(X表示目标基因的相对内参基因的表达量；CT表示荧光信号达到设定阈值需要的循环数；ΔCT表示目标基因相对内参基因的差异；ΔΔCT表示目标基因与参照基因的ΔCT差异)确定3个基因在不同组织的时序表达情况[11]。

表1 3个节点基因及内参基因实时荧光定量PCR的引物序列

2 结果与分析

2.1BpLFY和BpFLC基因的序列分析

从6个白桦转录组的Unigene序列拼接后获得BpLFY和BpFLC基因全长cDNA序列。获得的BpLFY基因cDNA为 1 514 bp，其中5’UTR 103 bp，3’UTR 196 bp，编码区长 1 215 bp，编码405个氨基酸，分子量为45.3 kD，理论等电点为6.52。BpFLC基因cDNA为 1 005 bp, 其中5’UTR 193 bp，3’UTR 185 bp，编码区长627 bp，编码209个氨基酸，分子量为11.4 kD，理论等电点为9.89(表2)。通过BLASTP比对，这2个基因分属于FLO-LFY超家族和MADS超家族(图1)。

表2 白桦BpLFY和BpFLC的序列特征

经BLASTX序列比对， BpLFY与胡桃(Juglansregia)、 山核桃(Caryacathayensis)LFY的同源性分别为91%和88%；BpFLC与葡萄(Vitisvinifera)、咖啡(Coffeaarabica)FLC的同源性分别为74%和52%。并通过系统进化树进一步验证了克隆的2个基因为LFY和FLC(图2)。

2.2 3个节点基因的功能分析

通过使用在线软件PLACE对3个节点基因的启动子进行分析，发现3个基因的启动子区除了启动子保守序列CAAT-box和TATA-box外，均含有不同数量的花粉特异表达的顺式作用元件POLLEN1LELAT52(AGAAA)和花粉晚期基因启动元件GTGANTG10(GTGA)，其中前者在BpSOC1、BpLFY和BpFLC基因中的数量分别为3个、3个和4个；后者为5个、7个和5个。除此之外还含有一些胁迫应答元件，如干旱响应元件(MYB1AT、MYBCORE、MYCATRD22、MYB2CONSENSUSAT)、伤害响应元件(WBOXNTERF3、WBOXATNPR1、DOFCOREZM)、脱落酸响应元件(WRKY71OS、CGCGBOXAT)、低温响应元件(MYCCONSENSUSAT)及热休克响应元件(CCAAT-box)(表3)。

表3 BpSOC1、BpLFY和BpFLC基因启动子区域主要顺式作用元件

2.3 4个节点基因在白桦不同组织中的表达分析

在对拟南芥等模式植物的研究中发现，在花时调控路径中FLC作为SOC1的抑制因子作用于SOC1的上游，LFY是SOC1的直接靶基因，是花时调控路径的下游基因，同时也是最重要的花分生组织决定基因之一[12-13]。为研究这3个节点基因在白桦不同组织部位的作用关系，以6月25日的白桦茎尖中各基因各自的表达量为对照，分别研究其在白桦不同组织部位(茎尖、叶片、雄花序和腋芽)中的时序表达。

2.3.1BpSOC1在白桦不同组织中的表达分析 从6月末至8月中旬，BpSOC1在茎尖、叶片和雄花序中的表达趋势基本一致，即在7月末达到一个高峰，从7月末到8月中旬表达量呈下降趋势(图3)。在这3个组织部位中表达量最高的时期均为7月末，表达量最低的时期均为8月中旬。在茎尖中BpSOC1在7月末的表达量为8月中旬的6倍，在叶片中BpSOC1在7月末的表达量为8中旬的2倍，在雄花序中BpSOC1在7月末的表达量为8月中旬的4倍。然而在腋芽中BpSOC1从6月末至8月中旬4个时期中的表达量为极显著的下降趋势，其中表达量最高的时期为6月末，表达量最低的时期为8月中旬。可见，在相同时期，BpSOC1在白桦的不同组织部位中表达存在差异。

在6月末，BpSOC1在腋芽中的表达远高于其他3个部位，均高出3个部位表达量的4倍以上；在7月中旬，BpSOC1在叶片中的表达量相对最高，其次是在腋芽和茎尖中，BpSOC1相对表达量最低的部位为雄花序，仅是叶片中表达量的0.24倍；在7月末，BpSOC1在白桦不同组织中的表达量差异并不明显，其中BpSOC1在茎尖和叶片中相对较高，在雄花序和腋芽中相对较低；在8月中旬，BpSOC1在白桦不同组织部位中的表达量均显著低于其他3个时期，但其中表达量相对较高的部位为叶片，约为此时期其他组织BpSOC1表达量的3～4倍。

2.3.2BpLFY在白桦不同组织中的表达分析 从6月末至8月中旬，BpLFY在茎尖、叶片、雄花序和腋芽中的表达有相似的趋势，即在6月末表达量最高，而8月中旬表达量最低。在4个部位中，表达最低的部位是茎尖和叶片，并在整个生长季呈现下降的趋势。LFY在雄花序和腋芽的表达量明显高于其他2个部位，在腋芽中LFY的表达呈逐渐下降的趋势，即表达量最高的时期为6月末，其次为7月中旬和7月末，表达量最低的为8月中旬。而BpLFY在6月末雄花序中具有较高的表达水平，其在6月末表达量是8月中旬的29.6倍，后期表达量明显下降。这说明BpLFY基因的表达也具有组织特异性，且主要表达部位为6月份的雄花序和腋芽(图4)。

2.3.3BpFLC在白桦不同组织中的表达分析BpFLC在白桦不同组织部位的表达模式明显不同(图5)。在7月末BpFLC的表达量最高，而其他时期的表达量基本一致；BpFLC在叶片中的表达趋势与茎尖中相反，BpFLC在7月末的表达量最低，其他时期的表达量相对较高，其中最高峰出现在8月中旬，为7月末表达量的3.8倍；BpFLC在雄花序中的表达随着白桦生长季的推移呈现极显著上升的趋势，即BpFLC表达在6月末到8月中旬这4个时期中逐渐增加，BpFLC在8月中旬的表达量是6月末表达量的7.2倍；然而BpFLC在腋芽中的表达趋势与雄花序中正好相反，即从6月末到8月中旬逐渐减少，BpFLC在6月的表达量是8月中旬的4.7倍。

在相同时期，BpFLC在白桦不同组织部位的表达量存在差异。由图5可看出，6月末、7月中旬和7月末，BpFLC在白桦腋芽中的表达量均高于其他部位。在6月末和7月中旬，BpFLC表达量最低的部位均在雄花序，表达量为腋芽中的0.06倍和0.17倍，其次为茎尖，表达量为腋芽中的0.17倍和0.25倍；在7月末，BpFLC在叶片中的表达量最低，为腋芽中的0.26倍，而在茎尖和雄花序中的表达量与腋芽中相差不大；在8月中旬，BpFLC在白桦雄花序中的表达量相对最高，其次为叶片，在茎尖和腋芽中的表达量相对最低。可见，BpFLC在白桦不同组织部位的表达模式各不相同。

3 结论与讨论

通过对BpFLC蛋白结构分析，发现该蛋白含有丰富的精氨酸和谷氨酸，同时含有大量DNA结合位点保守的MADS结构域，表明该基因蛋白属于典型的MADS-box转录因子。通过NCBI的Blast X比对，发现BpLFY与胡桃的氨基酸序列相似度达到91%，与山核桃、栗树和葡萄的同类基因相似度达到80%以上，说明LFY基因在进化上是高度保守的。

通过对BpLFY、BpFLC和BpSOC1基因启动子序列的分析，推测3个基因可能参与花发育的过程。从BpFLC、BpSOC1和BpLFY在白桦不同组织部位的时序表达中也可以看到，BpSOC1、BpLFY和BpFLC在雄花序中均呈现出较高的表达量，说明3个基因与雄花发育有关。BpSOC1和BpFLC在白桦茎尖、叶片、雄花序和叶片中均有表达，在拟南芥中SOC1在各个部位均表达，其表达量随着营养生长的进程而增加[14-15]，并且不仅作用于植物开花时间的调控，还在花分生组织的决定和成花图谱中具有作用[14-16]。BpLFY虽然只在雄花序中大量表达，但在腋芽中也具有相对较高的表达量，表明该基因参与了翌年白桦花芽的形成。

在叶片中BpFLC和BpSOC1的表达趋势刚好相反，即随着白桦生长季的进行，BpFLC的表达量是先下降后上升，在7月末达到一个表达低谷，而BpSOC1则是先上升后下降，在7月末达到一个表达高峰。表明白桦中BpFLC和BpSOC1在叶片中存在一个上下调控关系，FLC在拟南芥叶片中表达，能够通过抑制SOC1来调控(推迟)开花[17]。值得一提的是，BpLFY在雄花序中6月末到7月10日之间相对于白桦其他时期和组织具有非常高的表达水平，而BpFLC和BpSOC1在此时的表达量均显著低于白桦其他时期和部位，这与Lee等[13]报道的BpLFY作为花分生组织特异基因和花器官决定基因在花器官形成过程中通过抑制成花计时基因(BpSOC1)的表达来保证花组织的正常发育一致。对于BpLFY、BpFLC和BpSOC1这3个转录因子之间深层的分子调控机制，尚有待于进一步研究。

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(责任编辑 张 坤)

Cloning and Expression Analysis of Flowering Regulation Related GenesFLC、LFYandSOC1 ofBetulaplatyphylla

WANG Zi-jia, JIANG Jing, LIU Gui-feng, LIU Fei-fei, LI Hui-yu

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding(Northeast Forestry University), Harbin Heilongjiang 150040, China)

LFY,FLCandSOC1 genes are key node genes in flowering regulation network. To characterize their function in birch, complete cDNA sequences ofLFYandFLCwere obtained from transcriptome datas ofBetulaplatyphylla, namedBpLFYandBpLFY, respectively.BpLFYwas 1 215 bp in length, encoding a protein of 405 amino acid residues with the molecular mass of 45.3 kD. The length ofBpLFYgene cDNA was 627 bp, encoding 209 amino acid residues with the molecular mass of 11.4 kD, the two genes belonged to FLO-LFY and MADS superfamily, respectively. Analysis of promoters of these genes showed that promoters of all these genes contained two cis-acting elements of pollen specific expression. In different tissues (shoot tip, leaf, male inflorescence and axillary), gene expression ofBpLFY,BpFLCandBpSOC1 genes were investigated by using real-time quantitative RT-PCR. The results showed thatBpSOC1 andBpFLCwere expressed in various tissues of birch, however,BpLFYwas expressed only in the male inflorescence and axillary, andBpFLCcan inhibitBpSOC1 expression in the leaves.

Betulaplatyphylla;FLC；LFY；SOC1；analysis of promoter；gene expression

2014-01-13

“十二五”农村领域国家科技计划课题(2013AA102704)资助。

李慧玉(1978—)，女，博士，副教授。研究方向：林木遗传育种。Email:lihuiyu0519@aliyun.com。

10.3969/j.issn.2095-1914.2014.04.004

S722

A

2095-1914(2014)04-0020-06

第1作者：王子佳(1989—)，男，硕士生。研究方向：林木遗传育种。Email:773615635@qq.com。