拮抗农业致病真菌放线菌菌株CTF619—D的分离、筛选及初步鉴定

康敬芹　吕跃东　王勇　刘杨　张良

摘要：从黄河中分离筛选出若干放线菌菌株，并对放线菌菌株进行分离纯化，采用琼脂块法进行初筛，用纸片扩散法和生长速率法对抑菌效果较好的菌株进行抑菌活性复筛，发现菌株CTF619-D的发酵产物对番茄炭疽病菌、黄瓜炭疽病菌、苹果腐烂病菌等10多种真菌均有不同程度的抑制作用，其中对番茄炭疽病菌的抑菌圈最大能达到2.8 cm。通过对CTF619-D菌株形态特征、培养特征、生理生化特征、16S rDNA序列及系统发育分析等方面的研究发现，CTF619-D菌株与淡紫灰链霉菌（Streptomyces lavendulae）FSHJ9菌株的序列同源性达100%，但在形态特征、培养特征和生理生化特性方面与其存在差异，因此初步确定CTF619-D为淡紫灰链霉菌的一个新变种。

关键词：放线菌；拮抗；生理生化；16S rDNA

中图分类号：S182文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）01-0086-04

收稿日期：2013-06-06

基金项目：辽宁省教育厅项目（编号：2009A374）。

作者简介：康敬芹（1987—），女，山东乐陵人，硕士研究生，研究方向为生物制药及剂型加工与应用。E-mail：xiaokang586@126.com。

通信作者：吕跃东，副教授，主要从事生物制药及剂型加工与应用研究。E-mail：lyd9900@163.com。放线菌是一类具有广泛实际用途和巨大经济价值的微生物资源。它突出的特性之一是能产生大量的、种类繁多的抗生素，是生产抗生素的主要菌群，是研制新医药、新农药和生物防治活菌剂的源头[1]。据估计，在全世界发现的8 000多种生物活性物质中，近70%是由放线菌产生的[2]。因此，为了达到高效、环保的生物防治目的，筛选和利用拮抗放线菌已成为当前农业科学研究的热点之一。在新抗生素的筛选分离过程中，从黄河土壤中分离出了1株具有较强活性的放线菌菌株CTF619-D，该菌株对多种植物农业病原真菌具有较强的抑制作用。本研究主要对该菌株的形态特性、培养特征、生理生化特征、16S rDNA序列及系统发育分析等方面进行分析，以确定其分类地位，并对活性成分的抗菌谱进行初步研究，旨在发现新的抗生素或原有抗生素新的防治特性，为丰富防治水果蔬菜病菌的生物农药种类提供实践经验和理论依据，为农用抗生素的研究与应用奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试放线菌放线菌由采自黄河的不同水样和土样中分离得到。

1.1.2供试病原菌以下病原菌均由辽宁科技大学生物工程系生物制药工艺室提取：（1）香蕉灰纹病菌（Cordana musae）；（2）油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）；（3）黄瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）；（4）番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）；（5）辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）；（6）黄瓜黑星菌（Cladosporium cucumerinum）；（7）番茄叶霉病菌（Fulvia fulva）；（8）水稻恶苗病菌（Fusarium moniliforme）；（9）番茄炭疽病菌（Colletotrichum lycopersici）；（10）稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）；（11）小麦纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis）；（12）棉花黄萎病菌（Fusarium oxysporum）；（13）小麦根腐霉病菌（Helminthosporium sorokinianum）；（14）苹果腐烂病菌（Cytospora sp.）；（15）黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum）；（16）水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）；（17）小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）；（18）稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）；（19）黄瓜角斑病菌（Pseudomonas syringae pv. lachrymans）；（20）姜瘟病菌（Pseudomonas solanacearum）。

1.1.3培养基分离所用培养基：高氏一号培养基+重铬酸钾[3-5]（0.6×10-6～0.7×10-6 g/L），pH值为7.4；放线菌培养所用培养基：高氏一号琼脂培养基；病原菌培养及拮抗试验所用培养基：PDA培养基；鉴定所用培养基参照《放线菌：属和种的分类、鉴定和描述》[6]。

1.1.4主要仪器与设备LRH-250A型生化培养箱，TGL-16C型高速离心机，ZHWY-2102型恒温培养振荡器，Autoelavo ES-315型高压灭菌锅，T-203型电子天平，SW-CJ-5 型超净工作台，Motic BA400型数码成像光学显微镜，JSM-6360LV型电子扫描显微镜，TaKaRa Thermal Cycler Dice TP600型PCR扩增仪，Mupid型核酸电泳仪，Image Master VDS电泳成像装置，EPS300型蛋白质电泳仪，ABI PRISMTM 3730XL DNA Sequencer型DNA测序仪。测序用试剂：BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit 试剂盒；TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒。

1.2方法

1.2.1放线菌的分离和纯化将土壤自然风干，在28 ℃条件下放置5～7 d，用研钵磨细以重铬酸钾[3-5]（0.6×10-6～0.7×10-6 g/L）为抑菌剂，采用稀释涂布法对土壤中的放线菌进行分离，然后置于28 ℃生化培养箱内倒置培养7～10 d，观察放线菌的生长情况，根据菌落形态选取不同菌株，经纯化后将单菌落转接到高氏一号斜面培养基上编号培养14 d，然后于4 ℃保藏。

1.2.2菌株的初筛采用固体平板发酵培养的方法筛选[7]，即高氏一号培养放线菌7～10 d，将长好的放线菌打孔后反向放置于接种了农业治病真菌的平板中央，在25 ℃条件真菌培养箱中培养2～3 d后观察测量抑菌圈。试验过程均设3个重复。

1.2.3菌株的复筛采用滤纸片法[8]测定发酵滤液对植物病原菌的拮抗性。将初筛所得放线菌菌株在28 ℃、150 r/min 条件下液体振荡培养7 d，将培养液4 000 r/min无菌离心10 min。将无菌滤纸片在离心所得上清液中浸泡 3 min 后置于接种农业致病真菌的PDA平板中央，于25 ℃条件下恒温培养72 h后，再分别测量抑菌圈直径。对照为浸无菌水的滤纸片。试验设3个重复。最终确定抑菌活性明显的菌株作为目的生防菌。

1.2.4放线菌鉴定通过观察菌株CTF619-D的菌丝形态、孢子和孢子丝形状、菌株在不同培养基上的培养特征以及一系列的生理生化特征，按照《链霉菌鉴定手册》[9]对菌株CTF619-D进行初步的分类鉴定。

（1）形态特征。将菌株CTF619-D接种于高氏一号培养基上，在28 ℃下插片培养7～10 d后，分别用光学显微镜和电子扫描显微镜观察插片上的基内菌丝、气生菌丝、孢子丝和孢子的形态特征。

（2）培养特征。将菌株CTF619-D分别接种在不同的培养基上（Ⅰ.高氏一号合成培养基，Ⅱ.葡萄糖天门冬素琼脂培养基，Ⅲ.PDA培养基，Ⅳ.伊莫松培养基，Ⅴ.牛肉膏蛋白胨培养基，Ⅵ.无机盐淀粉琼脂培养基，Ⅶ.高氏一号培养基，Ⅷ.马铃薯浸汁培养基，Ⅸ.蔗糖察氏培养基），置于28 ℃生化培养箱中培养，分别在10、20 d观察培养基内菌丝、气生菌丝、可溶性色素的颜色及表观特征。

（3）生理生化指标。参照《链霉菌鉴定手册》对菌株CTF619-D进行以下生理生化试验：Ⅰ.明胶液化试验，Ⅱ.淀粉水解试验，Ⅲ.牛奶凝固与胨化，Ⅳ.硝酸盐还原反应，Ⅴ.纤维素分解试验，Ⅵ.产生硫化氢试验，Ⅶ.产生黑色素试验，Ⅷ.碳源的利用试验等，检测观察菌株的生理生化指标[10]。

（4）16S rDNA测序及序列分析。在80 ℃下挑取用试管培养的CTF619-D新鲜菌体变性15 min，然后离心取上清液作为模板进行PCR扩增。扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 变性1 min，55 ℃复性1 min，72 ℃延伸1.5 min，30个循环；72 ℃延伸5 min。取5 μL进行3%琼脂糖凝胶电泳，使用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒切胶回收目的片段后，经大连宝生物（工程）有限公司完成DNA测序。用微波法[11]提取总DNA，以Seq Forward、Seq Internal、Seq Reverse为引物进行DNA测序，采用正向引物（27 f）5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′、反向引物（1 492 f）5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′将测得的基因序列复制到Blast程序中，与GenBank中核苷酸数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）进行对比分析，然后选取与试验菌株序列相似度较高的菌株，利用DNAstar软件对目标序列绘制系统发育树，并对所构建的进化树进行评估[12]，确定所测菌株的分类地位[13]。

2结果与分析

2.1活性菌株的分离和筛选

对20多株放线菌进行抑菌活性的初筛，大多数菌株抑菌活性很低，但CTF619-D对多数植物病原真菌有抑制效果，其中对黄瓜炭疽病菌和番茄炭疽病菌抑制效果很好（图1、表1）。

2.2放线菌CTF619-D菌株的鉴定

2.2.1形态特征观察 拮抗放线菌CTF619-D菌株在高氏一号培养基上28 ℃培养7～10 d后，可形成基内菌丝和气生菌丝，在电子显微镜下观察，放线菌CTF619-D基内菌丝不断裂，无横隔，成分枝状；气生菌丝发达，成熟后发育成孢子

2.2.2培养特征观察菌株在不同的培养基上表现出不同的生长情况，并形成丰富的气生菌丝和基内菌丝（表2）。

2.2.3生理生化特性菌株革兰氏染色呈阳性，生长温度范围为5～40 ℃，最适温度为28 ℃，生长pH值范围为5～10，最适pH值为7.0。菌株CTF619-D可使明胶缓慢液化；能够水解淀粉；使牛奶不凝固，但胨化；不能水解纤维素；硝酸盐还原反应为阳性；能够产生H2S、黑色素；能利用甘露醇、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、淀粉、D-木糖、果糖、肌醇、乳糖、鼠李糖等（表3）。

3结论

本试验主要通过稀释分离的方法从采集的土壤中得到若干放线菌，进而用20种农业致病真菌对其进行初筛和复筛，选出抑菌效果好的放线菌CTF619-D，对其进行发酵培养，并采用抑制菌丝生长速率法对抗菌物质进行抗菌活性测定，结果表明，CTF619-D对番茄炭疽病菌、黄瓜炭疽病菌有较好的抑菌效果，其中对番茄炭疽病菌的抑菌圈直径最大能达到2.8 cm。通过形态学鉴定、培养特征观察、生理生化指标测定、16s rDAN序列的测定及系统进化树分析，结果表明，CTF619-D菌株与淡紫灰链霉菌FSHJ9聚为一支，序列同源性达到100%，但其形态特征、培养特征和生理生化特性方面又存在着明显的区别，因此可初步确定CTF619-D为淡紫灰链霉菌的一个新变种，命名为淡紫灰链霉菌黄河变种。另外

该菌株是否能看作是农用抗生素的一个新来源，还需要后续试验来进一步验证。

据报道，在植物病害生物防治中，拮抗微生物主要是链霉菌属及其相关类群[14]，淡紫灰链霉菌是一类重要的抗生素产生菌，它产生的医用抗生素（如薰衣草菌素、链丝菌素）和农用抗生素（如中生菌素等）都已有广泛的用途[15]。目前，国内关于拮抗淡紫灰链霉菌鉴定的诸多研究中，除产生中生菌素的淡紫灰链霉菌海南变种外，未见有其他淡紫灰链霉菌变种的报道。因此CTF619-D是一株有价值的具生物活性的生防菌株，该菌株有效活性成分分离鉴定及其抑菌机理均有待进一步研究，以期开发在瓜果蔬菜病害防治领域中具有应用前景的抗菌物质。

参考文献：

[1]安德荣，慕小倩，刘翠娟，等. 土壤拮抗放线菌的分离和筛选[J]. 微生物学杂志，2002，22（5）：1-3.

[2]苏涛，马宗琪，司美茹. 鲁西南地区土壤放线菌的生态分布[J]. 山东农业科学，2006（2）：57-60.

[3]刘志恒，姜成林. 放线菌现代生物学与生物技术[M]. 北京：科学出版社，2004：242-250.

[4]安德荣，慕小倩，赵文军. 土壤放线菌分离中抑制剂的应用研究[J]. 西北农业学报，2002，11（1）：106-108.

[5]周德庆. 微生物学实验手册[M]. 上海：上海科学技术出版社，1986：164-194.

[6]瓦克斯曼S A. 放线菌：属和种的分类、鉴定和描述[M]. 北京：科学出版社，1974.

[7]张致平. 微生物药物学[M]. 北京：化学工业出版社，2003：10-16.

[8]林 虹，蒲小明，张荣柳，等. 放线菌抗真菌活性筛选及其中一菌株的初步研究[J]. 暨南大学学报：自然科学与医学版，2012，33（1）：76-80.

[9]中国科学院微生物研究所放线菌分类组. 链霉菌鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，1975.

[10]李鹏，高鹏，王健鑫.一株有抑菌活性海洋放线菌的筛选及鉴定[J]. 生物技术，2010，20（5）：50-53.

[11]徐平，李文均，徐丽华，等. 微波法快速提取放线菌基因组DNA[J]. 微生物学通报，2003，30（4）：82-84.

[12]Bikrol A，Saxena N，Singh K. Characterization of Bradyrhizobium strains isolated from different varieties of soybean with 16S rDNA RFLP from agricultural land of Madhya Pradesh，India[J]. Indian Journal of Microbiology，2010，50（4）：404-411.

[13]金光，张晓华. 海洋新菌的分类与鉴定方法[J]. 中国海洋大学学报：自然科学版，2011，41（4）：69-76.

[14]Akira E，Kazuo K，Tomomasa M，et al. Mechanism of action of the antifugal agent polyoxin D[J]. Journal of Bacteriology，1970，104（1）：189-196.

[15]朱昌雄，蒋细良，孙东园，等. 新农用抗生素中生菌素[J]. 精细与专用化学品，2002（16）：14-17.荆英，董文霞，黄建. 杀虫剂对烟粉虱卵与捕食性天敌小黑瓢虫的选择毒力[J]. 江苏农业科学，2014，42（1）：90-92.

参考文献：

[1]安德荣，慕小倩，刘翠娟，等. 土壤拮抗放线菌的分离和筛选[J]. 微生物学杂志，2002，22（5）：1-3.

[2]苏涛，马宗琪，司美茹. 鲁西南地区土壤放线菌的生态分布[J]. 山东农业科学，2006（2）：57-60.

[3]刘志恒，姜成林. 放线菌现代生物学与生物技术[M]. 北京：科学出版社，2004：242-250.

[4]安德荣，慕小倩，赵文军. 土壤放线菌分离中抑制剂的应用研究[J]. 西北农业学报，2002，11（1）：106-108.

[5]周德庆. 微生物学实验手册[M]. 上海：上海科学技术出版社，1986：164-194.

[6]瓦克斯曼S A. 放线菌：属和种的分类、鉴定和描述[M]. 北京：科学出版社，1974.

[7]张致平. 微生物药物学[M]. 北京：化学工业出版社，2003：10-16.

[8]林 虹，蒲小明，张荣柳，等. 放线菌抗真菌活性筛选及其中一菌株的初步研究[J]. 暨南大学学报：自然科学与医学版，2012，33（1）：76-80.

[9]中国科学院微生物研究所放线菌分类组. 链霉菌鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，1975.

[10]李鹏，高鹏，王健鑫.一株有抑菌活性海洋放线菌的筛选及鉴定[J]. 生物技术，2010，20（5）：50-53.

[11]徐平，李文均，徐丽华，等. 微波法快速提取放线菌基因组DNA[J]. 微生物学通报，2003，30（4）：82-84.

[12]Bikrol A，Saxena N，Singh K. Characterization of Bradyrhizobium strains isolated from different varieties of soybean with 16S rDNA RFLP from agricultural land of Madhya Pradesh，India[J]. Indian Journal of Microbiology，2010，50（4）：404-411.

[13]金光，张晓华. 海洋新菌的分类与鉴定方法[J]. 中国海洋大学学报：自然科学版，2011，41（4）：69-76.

[14]Akira E，Kazuo K，Tomomasa M，et al. Mechanism of action of the antifugal agent polyoxin D[J]. Journal of Bacteriology，1970，104（1）：189-196.

[15]朱昌雄，蒋细良，孙东园，等. 新农用抗生素中生菌素[J]. 精细与专用化学品，2002（16）：14-17.荆英，董文霞，黄建. 杀虫剂对烟粉虱卵与捕食性天敌小黑瓢虫的选择毒力[J]. 江苏农业科学，2014，42（1）：90-92.

参考文献：

[1]安德荣，慕小倩，刘翠娟，等. 土壤拮抗放线菌的分离和筛选[J]. 微生物学杂志，2002，22（5）：1-3.

[2]苏涛，马宗琪，司美茹. 鲁西南地区土壤放线菌的生态分布[J]. 山东农业科学，2006（2）：57-60.

[3]刘志恒，姜成林. 放线菌现代生物学与生物技术[M]. 北京：科学出版社，2004：242-250.

[4]安德荣，慕小倩，赵文军. 土壤放线菌分离中抑制剂的应用研究[J]. 西北农业学报，2002，11（1）：106-108.

[5]周德庆. 微生物学实验手册[M]. 上海：上海科学技术出版社，1986：164-194.

[6]瓦克斯曼S A. 放线菌：属和种的分类、鉴定和描述[M]. 北京：科学出版社，1974.

[7]张致平. 微生物药物学[M]. 北京：化学工业出版社，2003：10-16.

[8]林 虹，蒲小明，张荣柳，等. 放线菌抗真菌活性筛选及其中一菌株的初步研究[J]. 暨南大学学报：自然科学与医学版，2012，33（1）：76-80.

[9]中国科学院微生物研究所放线菌分类组. 链霉菌鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，1975.

[10]李鹏，高鹏，王健鑫.一株有抑菌活性海洋放线菌的筛选及鉴定[J]. 生物技术，2010，20（5）：50-53.

[11]徐平，李文均，徐丽华，等. 微波法快速提取放线菌基因组DNA[J]. 微生物学通报，2003，30（4）：82-84.

[12]Bikrol A，Saxena N，Singh K. Characterization of Bradyrhizobium strains isolated from different varieties of soybean with 16S rDNA RFLP from agricultural land of Madhya Pradesh，India[J]. Indian Journal of Microbiology，2010，50（4）：404-411.

[13]金光，张晓华. 海洋新菌的分类与鉴定方法[J]. 中国海洋大学学报：自然科学版，2011，41（4）：69-76.

[14]Akira E，Kazuo K，Tomomasa M，et al. Mechanism of action of the antifugal agent polyoxin D[J]. Journal of Bacteriology，1970，104（1）：189-196.

[15]朱昌雄，蒋细良，孙东园，等. 新农用抗生素中生菌素[J]. 精细与专用化学品，2002（16）：14-17.荆英，董文霞，黄建. 杀虫剂对烟粉虱卵与捕食性天敌小黑瓢虫的选择毒力[J]. 江苏农业科学，2014，42（1）：90-92.