质粒介导的RNAi沉默 mdr1基因增强白血病耐药细胞HT9对姜黄素的敏感性

李旭艳　邵淑丽　张伟伟　恽东泽　付博　张珍珠

摘要：通过pSilencer 2.1质粒介导的RNAi技术沉默急性早幼粒白血病耐药HT9细胞的耐药基因mdr1表达，可提高耐药细胞对姜黄素的敏感性。通过设计合成靶向mdr1基因的shRNA干扰片段，定向克隆到pSilencer 2.1-U6 neo质粒中，成功构建沉默mdr1基因特异表达的shRNA表达载体，电转染HT9细胞后筛选阳性克隆扩大培养。采用实时荧光定量PCR、Western blot检测细胞mdr1基因表达情况，流式细胞术检测P-糖蛋白外排泵功能，MTT法和流式细胞技术检测细胞对药物敏感性和细胞周期分布。结果显示，构建的shRNA表达载体pU6/shRNA/mdr1转染HT9细胞后，HT9/pU6/shRNA细胞mdr1 mRNA表达降低了78.84%（P<0.01），P-糖蛋白的表达量降低了48.27%（P<0.05），细胞内Rho123相对荧光强度由10.8%±058%升高至73.56%±1.37%；转染细胞对姜黄素敏感性明显增强，IC50由（24.10±0. 83） μmol/L降至（5.10±014） μmol/L；耐药相对逆转率为84.74%±1.86%，与HT9细胞相比，经姜黄素处理的稳定转染细胞HT9/pU6/shRNA细胞周期阻滞在S、G2/M期。说明质粒介导的shRNA表达载体pU6/shRNA/mdr1能够稳定、持久地抑制mdr1基因表达，能有效增强HT9细胞对姜黄素的敏感性。

关键词：shRNA；pSilencer 2.1-U6 neo质粒；多药耐药性；HT9细胞；姜黄素

中图分类号：R961文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）01-0022-04

收稿日期：2013-06-06

基金项目：黑龙江省自然科学基金（编号：C200624）；黑龙江省教育厅科技项目（编号：11511447、12511611）。

作者简介：李旭艳（1982—），女，山东阳谷人，硕士，讲师，从事分子生物学研究。Tel：（0452）2742695；E-mail：lxy0702@126.com。

通信作者：邵淑丽，博士，教授，从事分子生物学研究。Tel：（0452）2738219；E-mail：shshl32@163.com。近年来，白血病的治愈率已有明显提高，但由于白血病细胞中存在多种耐药相关基因异常的高表达，致使白血病细胞对抗癌药物产生耐药性，导致部分白血病患者治疗失败或在化疗后复发。研究表明，多药耐药基因mdr1的过表达成为经典的多药耐药表型[1-2]。mdr1基因的表达产物P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）可以利用ATP水解释放的能量将化疗药物泵出细胞外，使细胞内药物浓度始终维持在低水平，使药物的细胞毒作用减弱，从而导致细胞产生耐药性[1]。P-糖蛋白对药物的特异性很小，能够运输多种结构不同的底物，如长春新碱、蒽环类药物（柔红霉素、阿霉素）、姜黄素、紫杉醇等，因此耐药细胞能对许多结构和作用机制不同的药物产生耐性。目前，RNA干扰（RNA interference，RNAi） 已用于沉默肿瘤细胞耐药基因表达，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[3-4]。本试验以质粒pSilencer 2.1-U6 neo为基础，成功构建了shRNA表达载体pU6/shRNA/mdr1，转染早幼粒白血病耐药HT9细胞，观察细胞mdr1基因表达情况、蛋白功能及细胞对姜黄素敏感性的变化。

1材料与方法

1.1材料

pSilencer 2.1-U6 neo由北京鼎国生物技术有限责任公司惠赠，人急性早幼粒白血病细胞株HL60、耐三尖杉酯碱的HL60细胞株HT9由北京师范大学生命科学学院提供，RPMI1640培养基、胎牛血清购自上海生工生物工程技术服务有限公司，鼠抗人单克隆抗体、HRP标记山羊抗鼠二抗为北京中山金桥生物技术有限公司产品。ECM830型电穿孔仪（BTX）；荧光定量RCP仪（Bio-Rad）；流式细胞仪FC500（Beckman）；7700 Real-Time PCR 仪（ABI）。

1.2方法

1.2.1pU6/shRNA/mdr1载体的构建根据GenBank P-糖蛋白编码基因mdr1 mRNA的已知序列（NM_000927），选择1 个shRNA特异性靶位点序列，设计合成编码shRNA的DNA模板序列：正义链GATCCGGAGGCCAACATACATGCCTTCAAGAGAGGCATGTATGTTGGCCTCCTTTTTTGGAAA；反义链AGCTTTTCCAAAAAAGGAGGCCAACATACATGCCTCTCTTGAAGGCATGTATGTTGGCCTCCG，退火形成双链，将其定向克隆到 pSilencer2.1-U6 neo载体上，shRNA重组质粒命名为 pU6/shRNA/mdr1。连接产物转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，测序验证插入序列无突变。大量提取纯化质粒，待转染。

1.2.2细胞培养及转染HT9细胞用含1.0 μg/mL三尖杉酯碱的培养液常规培养，试验前2 周取出三尖杉酯碱培养细胞。取对数生长期的HT9细胞，利用线性化的 pEGFP-N1质粒优化电转染条件，线性化的pSilencer 2.1-U6 neo 空质粒、pU6/shRNA/mdr1重组质粒于最佳电转染条件下转染HT9细胞，转染后的细胞为HT9/pU6（空载体对照转染细胞）、HT9/pU6/shRNA（转染重组质粒细胞），转染后用 600 μg/mL G418筛选建立稳定转染的HT9细胞克隆，有限稀释法挑取单克隆转染细胞。试验另设非耐药对照细胞HL60，耐药非转染对照细胞HT9。

1.2.3Real-time PCR检测mdr1 mRNA表达量采用UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒提取各组细胞总RNA，用Real-time PCR检测以上细胞mdr1基因的表达量。反应体系为25 μL：上、下游引物各0.25 μL，SYBR Green Ⅰ 1 μL，ddH2O 18 μL，cDNA 0.5 μL。循环参数：94 ℃预变性 3 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循环35次；72 ℃延伸。反应在ABI 7700 Real Time PCR仪上进行，以β-actin作为内参对照，引物序列具体情况见表1。表1引物序列与扩增片段长度

引物名称1引物序列（5′→3′）1扩增片段长度（bp）mdr11F：ATATCAGCAGCCCACATCAT；R：GAAGCACTGGGATGTCCGGT1154β-actin1F：ATCATGTTTGAGACCTTCAACA；R：CATCTCTTGCTCGAAGTCCA1318

1.2.4P-糖蛋白表达量的Western blot检测提取各组细胞总蛋白，测定样品纯度，再进行SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白电转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入鼠抗人P-糖蛋白单克隆抗体C219（1 ∶40），室温孵育1.5 h，PBS洗膜，HRP标记的山羊抗鼠二抗（1 ∶5 000），室温孵育1.5 h，ECL发光液显影、定影、洗片，用凝胶图像分析软件分析X光片灰度值。

1.2.5FCM检测P-糖蛋白外排泵功能收集对数生长期各组细胞，分别与10 μg/mL Rho123混匀，37 ℃孵育 30 min，用预冷的PBS洗细胞，再重悬于预冷的PBS中，用流式细胞仪检测细胞内Rho123荧光强度。

1.2.6MTT法检测耐药细胞对姜黄素敏感性收集对数生长期的各组细胞，按接种量1万个/孔接种于96 孔中，常规条件下分别与8个浓度梯度的姜黄素培养48 h，每个浓度3个平行，采用常规四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）于570 nm下测定吸光度D，计算细胞存活率：细胞存活率=D试验组/D对照组×100%，以药物浓度为横轴，细胞存活率为纵轴绘制浓度效应曲线，求出回归方程，确定半数抑制浓度（IC50），并计算相对逆转率：逆转率=[IC50（A）-IC50（B）]/[IC50（A）-IC50（C）]×100%，IC50（A）、IC50（B）、IC50（C）分别代表逆转前耐药细胞、逆转后耐药细胞和亲本敏感细胞的IC50。

1.2.7FCM检测细胞周期取对数生长期各组细胞100万个，接种100 mL 培养瓶内，分别加入终浓度为8.0 μmol/L姜黄素，培养48 h，800 r/min离心10 min收集细胞，与1 mL预冷的70%乙醇充分混匀，4 ℃保存，至少固定18 h，细胞浓度调整为100万个/mL，洗涤，重悬于1 mL含 20 μg/mL RNase A和50 μg/mL PI的染液中，37 ℃孵育30 min，用流式细胞仪检测细胞周期分布。

1.3数据处理

用SPSS 17.0进行数据处理，进行单因素方差分析，组间差异性分析采用LSD法，数据均以“平均数±标准差”表示。

2结果与分析

2.1pU6/shRNA/mdr1重组载体对mdr1-mRNA表达的影响

荧光定量PCR结果（图1）显示，HT9/pU6/shRNA细胞的mRNA 相对表达量极显著低于HT9 细胞、HT9/pU6细胞；与HT9 细胞相比，HT9/pU6/shRNA 细胞mdr1基因的相对表达量降低了78.84% （P<0.01）；HT9/pU6与HT9 细胞的mRNA 相对表达量差异不显著（P>0.05）；HT9/pU6/shRN与HL60细胞mRNA 相对表达量差异显著（P<0.05）。说明

重组质粒pU6/shRNA/mdr1对HT9 细胞目的基因mdr1的表达有一定的干扰作用，而空载体对目的基因表达无干扰作用。

2.2pU6/shRNA/mdr1重组载体对P-糖蛋白表达的影响

用Western blot检测各组细胞内P-糖蛋白水平，以其与内参β-actin的比值表示蛋白相对表达量。结果（图2）显示，HT9/pU6/shRNA细胞的P-糖蛋白表达量比HT9细胞低48.27%（P<0.05），HT9/pU6细胞与HT9 细胞蛋白相对表达量差异不显著（P>0.05），HT9/pU6/shRNA细胞与HL60细胞蛋白相对表达量差异显著（P<0.05）。证实了重组质粒pU6/shRNA/mdr1对HT9 细胞mdr1基因沉默的有效性。

2.3pU6/shRNA/mdr1重组载体对P-糖蛋白外排泵功能的影响

经流式细胞术分析（表2）可知，与HT9细胞相比，HT9/pU6/shRNA 细胞的Rho123荧光强度极显著增强（P<001），而HT9/pU6细胞内Rho123荧光强度变化不显著（P>005）；HT9/pU6/shRNA细胞与 HL60细胞内荧光强度差异极显著（P<0.01）。说明转染后的单克隆细胞 HT9/pU6/shRNA 的P-糖蛋白外排泵功能极显著增强。

2.4RNAi对HT9细胞的影响

HT9细胞的IC50与HL60细胞差异显著，进一步说明HT9 细胞具有高度耐药性。姜黄素药物浓度与细胞存活率呈负相关关系，相同作用条件下，HT9/pU6/shRNA细胞存活率降低最明显。与HT9 细胞相比，HT9/pU6/shRNA细胞对姜黄素的IC50极显著降低（P<0.01），而HT9/pU6细胞对姜黄素的IC50降低但差异不显著（P>0.05）；HT9/pU6/shRNA细胞对姜黄素的IC50与HL60细胞差异极显著（P<001），干扰片段对耐药细胞的耐药相对逆转率为（84.74±186）%（表3）。

2.5pU6/shRNA/mdr1重组载体对HT9细胞周期的影响

用流式细胞仪检测经姜黄素作用48 h的各组细胞周期显示，与HT9细胞相比，HT9/pU6/shRNA和HL60细胞周期

表2各组细胞内 Rho123的相对荧光强度情况

细胞1Rho123 相对应光强度（%）HT9110.80±0.58aAHT9/pU6110.44±0.45aAHT9/pU6/shRNA173.56±1.37bBHL60195.13±1.12cC注：同列数据后不同小写、大写字母表示差异显著（P<0.05）、极显著（P<0.01）（n=3）。下同。

发生了明显变化，表现为S、G2/M期细胞增多，HT9/pU6细胞周期未发生明显变化，说明转染细胞HT9/pU6/shRNA和HL60细胞周期经姜黄素处理后阻滞在S、G2/M期（图3）。

3结论与讨论

白血病是最常见的造血系统恶性肿瘤之一，目前联合化疗仍然是白血病治疗的重要措施，而白血病细胞多药耐药性的产生则使部分白血病的化疗或预后最终失败。研究表明，在经典的白血病多药耐药表型中，通过对P-糖蛋白的检测可以判断白血病病人对当前化疗药物是否具有抗性，以选择恰当的治疗方案。耐药逆转剂、免疫治疗、基因治疗等技术已被临床应用于提高肿瘤细胞对药物的敏感性，辅助提高肿瘤治愈率。RNA干扰技术是近年来发展起来的一项特异性抑制基因表达的基因治疗方法，这一特异、有效的基因沉默技术现已被广泛应用于肿瘤多药耐药等方面的研究[5-6]。Yague等将设计的2对pSUPER-shRNA质粒表达载体转染给白血病耐药细胞K562/ADR后，对mdr1基因表达的抑制率达95%、97%，细胞对药物的敏感性恢复至与K562细胞几乎相同的水平[7]。Alexandra等应用H1启动子介导的RNA干扰载体抑制胃癌EPG85-257RDB细胞mdr1基因表达，细胞耐药逆转率达74%[8]。

本试验成功构建了RNA干扰pU6/shRNA/mdr1重组质粒，该重组质粒利用RNA聚合酶Ⅲ U6启动子表达siRNA分子，有利于对靶基因表达受到抑制后细胞表型的长期变化进行观察，该重组质粒转染HT9细胞后，构建了长期有效的基因沉默细胞模型。经荧光定量PCR和Western检测可知，与HT9细胞相比，单克隆细胞HT9/pU6/shRNA的 mdr1基因表达量降低了78.84%（P<0.01），P-糖蛋白表达量降低了48.27%（P<0.05），RNAi对mdr1基因的表达起到了一定的抑制作用。经流式细胞术检测可知，转染后的HT9细胞内荧光强度由10.8%±0.58%增强到73.5%±1.37%，因Rho123是多药抗性细胞P-糖蛋白的底物，能被蛋白水解释放的能量从细胞内泵出，HT9/pU6/shRNA细胞内Rho123荧光强度的增强反映该细胞药物外排功能减弱。转染后，HT9细胞经姜黄素处理的IC50由（24.10±0.83） μmol/L降至（510±0.14） μmol/L，耐药相对逆转率为（84.74±186）%，经姜黄素作用48 h后，细胞周期阻滞在S、G2/M期。姜黄素的抗癌机制还未完全清楚，目前已发现它通过延长细胞周期使细胞在S 期和（或）G2/M期集聚，达到抗增殖的作用[9-10]，在本试验中已得到证实。

RNAi技术可通过双链短RNA（double-stranded RNA，dsRNA）触发同源性mRNA降解[11]，目前有2种方式可以获得双链短RNA。其一，体外合成siRNA分子后采用转染、电转化等方法将其导入细胞内发挥作用[12]；其二，利用表达载体或siRNA表达框转染细胞，在体内合成所需要的siRNA分子。体外合成siRNA易被降解，并需专门的RNA转染试剂转染细胞，在细胞内的干扰效应持续时间短，利用质粒、病毒类载体介导的siRNA表达载体克服了以上缺点[13]，同时载体上的抗性标记有助于快速筛选出转染的阳性单克隆细胞。目前，用于表达siRNA的启动子有RNA聚合酶Ⅲ类启动子（pol Ⅲ）及RNA聚合酶Ⅱ类启动子（pol Ⅱ）。这些启动子可以在体内高效转录小的、非编码的、在5′端无帽状结构、在3′端无多聚腺苷酸化的转录本，启动子总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA，遇到4～5个连续的U即终止，转录产物在第2个尿嘧啶处被切下来，非常精确，从而可以限制转录RNA的大小；另外，这类启动子本身序列较短，不会形成复杂的空间结构。目前U6、H1启动子介导的RNAi技术已在多种肿瘤耐药细胞中应用[14-15]。综上所述，利用质粒介导的RNAi可以有效抑制mdr1基因编码蛋白的表达和功能，提高耐药细胞对姜黄素的敏感性。本研究为白血病耐药逆转治疗提供了理论基础。

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