珊瑚状猴头菌多糖对大鼠肝抗氧化及代谢调节*

唐 鹏，李学英，王大忠，冯翠萍，韩爱丽

(1.遵义医学院细胞生物学与遗传学教研室，贵州 遵义 563003；2.山西农业大学食品科学与工程学院，山西 晋中 030801)

珊瑚状猴头菌多糖对大鼠肝抗氧化及代谢调节*

唐 鹏1，李学英1，王大忠1，冯翠萍2**，韩爱丽2

(1.遵义医学院细胞生物学与遗传学教研室，贵州 遵义 563003；2.山西农业大学食品科学与工程学院，山西 晋中 030801)

探讨珊瑚状猴头菌多糖的抗氧化作用和对大鼠肝脏代谢的相关基因表达的影响。将大鼠随机分为正常对照组、多糖干预组和模型组。对照组喂饲基础饲料，多糖干预组(剂量1组、剂量2组)和模型组喂饲高胆固醇饲料，同时多糖干预组(剂量1组、剂量2组)给予多糖灌胃5周，5周后处死大鼠取肝脏。分别测定大鼠肝脏的丙二醛(MDA)含量，总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶 (CAT)的活力。使用实时荧光定量PCR分别检测大鼠肝脏相关基因表达量：酰辅酶A：胆固醇酰基转移酶2(ACAT2)、卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)。与模型组比较：多糖剂量1组、剂量2组大鼠肝脏的MDA含量显著下降(p<0.01)，T-SOD活力显著升高(p<0.01)，GSH-Px活力显著升高(p<0.01)，CAT活力显著提高(p<0.01)；多糖剂量1组、多糖剂量2组大鼠肝脏的基因表达量ACAT2 mRNA显著下降(p<0.01)；LCAT mRNA显著升高(p<0.01)。珊瑚状猴头菌多糖具有显著的抗氧化作用，对大鼠肝脏的代谢具有调节作用。

珊瑚状猴头菌；多糖；胆固醇；基因表达；抗氧化性；代谢；肝脏

食用菌集各种营养于一身，是当前人类最有发展前途、最具希望的健康食品。活性多糖的最佳种类来自真菌多糖，其广泛的生物活性已逐渐被人们认知。食用菌多糖是功效十分显著的生物活性物质，是食药兼用菌中所含的最重要的药效成分，在国内外被称为“生物反应调节剂”。随着人们生活水平的提高，健康保健意识逐渐增强，作为药食同源的食用菌，其多糖的研究日益受到研究者关注。

真菌多糖是1种从真菌中提取获得的安全无毒的天然高分子聚合物[1]。目前已经开展了灵芝、茶树菇、猴头菇等食用菌多糖抗氧化活性及耐缺氧功能的研究。我国是最早栽培和利用食用菌的国家之一，资源非常丰富。大量的研究表明，食用菌的生物活性主要来自其多糖和多糖肽类，食用菌多糖能明显降低心肌组织的脂褐质含量，增强体内SOD酶(超氧化物歧化酶)活力，从而清除体内氧自由基等有害物质，具有良好的清除自由基功效，达到延缓衰老的效果[2]。随着一系列新型的、安全高效的真菌多糖药物和保健品迅速进入市场，毒副作用小、效率高的食用菌多糖越来越受到人们的重视。

高脂血症的发病率逐年升高，究其原因，脂质代谢异常是导致高血脂的直接原因，如何预防和治疗高胆固醇血症成为当前研究的重要课题。肝脏是合成脂肪酸和脂肪的主要场所，也是人体中合成胆固醇最旺盛的脏器，是血浆胆固醇的主要来源。此外，肝脏还合成并分泌卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)，促使胆固醇酯化。胆固醇生物合成的原料是乙酰辅酶A，胆固醇的分解代谢也在肝脏内进行。胆固醇在体内有着广泛的生理作用，但当其动态平衡遭到破坏，胆固醇过量会导致高胆固醇血症，脂质代谢失调。高胆固醇是导致动脉粥样硬化(AS)的主要危险因素之一，血浆胆固醇含量与冠心病及心肌梗塞的发生率呈正相关[3]。近年来有研究表明灵芝、香菇、黑木耳、猴头菇等食用菌多糖具有防治高血糖、高血脂的作用，红菇多糖能显著降低糖尿病小鼠的血糖值，同时甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇显著降低[4]。金耳多糖可以显著降低链脲霉素所致糖尿病小鼠血液中总胆固醇(TC)含量，其机理可能是多糖抑制了总胆固醇(TC)的吸收[5]。

猴头菌属多糖具有抗肿瘤、提高免疫力、抗凝血、降血脂等功效[6]，但目前关于珊瑚状猴头菌(Hericiumcoralloides)多糖的抗氧化作用研究鲜见报道,对大鼠肝脏ACAT2、LCAT影响的研究尚未见报道。因此，本实验利用珊瑚状猴头菌提取了水溶性好、安全无毒副作用的多糖，对多糖进行抗氧化及大鼠肝脏代谢调节的作用研究，旨在为珊瑚状猴头菌来源的新型高效多糖制剂研发及其深度开发利用提供可借鉴的技术资料。

1 材料和仪器

1.1 材料

受试动物及分组SD雄性大鼠，32只，体重(100±10)g, 清洁级，山西医科大学实验动物中心提供。随机分为正常对照组、多糖干预组(剂量1组、2组)和模型组4个组。

1.2 饲养条件

基础饲料、高胆固醇饲料由山西医科大学实验动物中心提供。饲养条件符合标准[室温(24±1)℃，相对湿度(55±10)%，12 h避光，每笼4只，自由饮水进食，每天清洗饮水瓶、添加饲料，及时清除霉变和污染饲料等，适应性喂养1周后，正常组喂饲基础饲料，其它各组喂饲高胆固醇饲料]。

1.3 主要仪器

FA1204B型电子分析天平(北京)；RE-52C型旋转蒸发器(上海)；BS210S型电子天平(北京)；DL-1型电子万用炉(天津)；TGL-16G型台式离心机(上海)；TDA-8002型电热恒温水浴锅(北京)；XW-80A型漩涡混合器(上海)；751G型可见光分光光度计(上海)；BSC-1000 II A2型生物安全柜(北京)；高速电动匀浆机(天津)；数显电热恒温烘箱(北京)；标准型pH计(德国)；凝胶成像系统(意大利)；可调式微量移液枪(德国)；Y96000型电子分析天平(上海)；ABI9700型普通PCR仪(美国)；5804R型冷冻离心机(德国)；DZKW-D-1型电热恒温水浴锅(北京)；Mx3000P型实时荧光定量PCR仪(美国)；BIO safe 12型生物安全柜(北京)；核酸蛋白测定仪(德国)；超低温冰箱(日本)；透析袋(上海)；冷冻干燥机(北京)。

1.4 主要试剂

超氧化物歧化酶SOD(Superoxide Dismutase)试剂盒、丙二醛MDA(Maleic Dialdehyde)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px测定试剂盒、CAT(Catalase)试剂盒、考马斯亮兰试剂盒，试剂盒均为南京建成生物工程有限公司产品；RNAiso Plus(Total RNA提取试剂)试剂盒、SYBR(r) Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)试剂盒、PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒，均为大连宝生公司产品；DEPC，加拿大BIO BASIC INC公司；PCR引物合成，上海生工生物工程技术服务有限公司；氯仿、异丙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚、苯酚、浓硫酸、葡萄糖常用试剂均为国产分析纯。

1.5 原料

珊瑚状猴头菌粉：山西农业大学食用菌中心提供。

2 方法

2.1 珊瑚状猴头菌多糖提取流程

珊瑚状猴头菌粉→热水浸提→过滤→离心(弃去残渣，留上清液)→乙醇沉淀 → 离心(弃去上清液)→(丙酮、乙醚)脱脂→透析→冷冻干燥→珊瑚状猴头菌多糖。

称取珊瑚状猴头菌干粉适量，以1∶40的料水比加蒸馏水，90℃恒温水浴浸提3 h；滤纸过滤；离心取上清液( 4 000 r·min-1，10 min)，浓缩，重复浸提1次然后加入4倍体积的乙醇，静置过夜。再进行离心，所得沉淀依次用丙酮、乙醚洗涤3次，烘干至质量恒定，取其适量用蒸馏水充分溶解，溶液置于透析袋中，用自来水淋洗48 h，再用蒸馏水透析24 h，然后用3倍体积的无水乙醇沉淀多糖，静置过夜， 4 000 r·min-1离心10 min后取沉淀，冷冻干燥至质量恒定，即为含糖量为75.28%的珊瑚状猴头菌多糖。以备实验使用。

2.2 给药方式

实验将大鼠随机分为正常对照组、多糖剂量1组(200 mg·kg-1)、多糖剂量2组(100 mg·kg-1)、模型组共4个组，每组8只大鼠；多糖干预组给药：根据大鼠体重将珊瑚状猴头菌多糖溶液按设定的剂量每天定时给大鼠灌胃1mL，同时对照组和模型组大鼠用生理盐水灌胃1mL；动物连续给药5周后，于末次给药12 h后处死大鼠并取其肝脏。

2.3 珊瑚状猴头菌多糖抗氧化作用研究

各组大鼠取肝脏200 mg进行匀浆，离心、沉淀，用于SOD、CAT、MDA、GSH-Px的测定，测定方法按照试剂盒说明书进行。

2.4 Real time PCR检测ACAT2 mRNA和LCAT mRNA的表达量

依试剂盒说明书,采用Trizol试剂盒提取肝脏总RNA；Taq-ManReverse Transcription Reagents试剂盒逆转录成cDNA；SYBRGreenPCRMasterMixreagentkits试剂盒进行扩增，其mRNA相对表达量采用2-ΔΔCt相对定量法[7]。

大鼠β-actin、LCAT、ACAT2 mRNA序列来源 (Gene Bank)，应用Primer5plμs引物设计平台设计试验引物，深圳华大基因有限公司合成。其引物序列、产物大小及位置见表1。

表1 引物序列、产物大小及位置

2.5 统计学处理

3 结果

大鼠肝脏SOD、CAT、MDA、GSH-Px含量的测定结果见表2。

与正常对照组相比,模型组大鼠肝脏的SOD、CAT、GSH-Px活力显著降低(p<0.01)，MDA含量显著升高(p<0.01)。与模型组相比，剂量1组、剂量2组大鼠肝脏SOD、CAT、GSH-Px活力显著升高，MDA含量显著下降(p<0.01)。

大鼠肝脏的基因表达检测结果见表3。

由表3可以看出，模型组和对照组相比，大鼠肝脏ACAT2 mRNA的表达量显著升高(p<0.01)；肝脏LCAT mRNA的表达量显著降低(p<0.01)。珊瑚状猴头菌多糖可下调ACAT2 mRNA的表达，剂量1组、剂量2组与模型组相比有显著差异(p<0.01)。珊瑚状猴头菌多糖可上调LCAT mRNA的表达，剂量1组和剂量2组与模型组相比有显著差异(p<0.01)。

表2 大鼠肝脏抗氧化能力测定结果

注：剂量1、剂量2组与模型组相比，*p<0.01，#p<0.05；模型组与对照组相比，*p<0.01，#p<0.05。

表3 大鼠肝脏ACAT2mRNA和 LCATmRNA相对表达量

注：剂量1、剂量2组与模型组相比，*p<0.01，#p<0.05；模型组与对照组相比，*p<0.01，#p<0.05。

4 讨论

在食药用真菌类发现的抗氧化活性物质，为氧化损伤相关疾病的治疗带来了新的希望，成为研发安全高效天然抗氧化剂值得关注的新途径。目前已经在灵芝、茶树菇、猴头菇等食用菌中展开了其多糖抗氧化活性及耐缺氧功能的研究。有文献报道，香菇、灵芝、猴头菇等食用菌多糖能够清除超氧自由基、DPPH、羟基自由基等自由基对人体的伤害，具有极强的抗氧化活性[8]。猴头菌丝多糖能明显提高小鼠血清、大脑、肝脏中SOD、CAT的含量，明显降低小鼠大脑、肝脏MDA水平，具有重要的抗氧化、延缓衰老功能[9]。

食用菌类多糖具有重要的生物学功能，具有抗氧化等多种生物活性。本实验对于珊瑚状猴头菌多糖的抗氧化及对大鼠肝脏代谢调节作用进行了研究。过量的自由基(Free radical)可对生物大分子、细胞器、细胞等造成累积性氧化损伤，导致组织损伤和器官功能衰退，诱导及加速机体衰老。动脉粥样硬化的发生与脂质过氧化损伤有关[10]。胆固醇、甘油三酯过高及血管壁上过多的脂类容易被自由基氧化，形成脂质过氧化物质在血管壁沉积，导致动脉粥样硬化(AS)[11]。多糖可通过提高SOD、CAT、GSH-Px等酶的活力从而发挥抗氧化的作用[12]。

LCAT能够抑制LDL氧化过程中的负电荷增加，防止在脂蛋白氧化过程中脂质被氧化。实验表明多糖可显著提高机体内LCAT活性，加速体内过剩胆固醇的清除。还可以显著提高机体内GSH-Px和SOD活力，抑制MDA升高，体内在SOD、CAT和GSH-Px的共同作用下清除超氧阴离子、羟自由基及过氧化氢，减轻或阻断过氧化物损伤。可能阻止HDL被氧化，从而保证体内过剩的胆固醇顺利排出。胆固醇酯分子较大，难以透过细胞膜，因此易被HDL分子运至肝脏清除[13]。

LCAT的活性有利于胆固醇的清除，可将细胞外高密度脂蛋白(HDL)的游离胆固醇酯化，高密度脂蛋白主要功能是将外围组织和血液中的胆固醇运送至肝脏进行代谢，被称为清道夫，具有抗动脉粥样硬化的作用[14]。研究发现高胆固醇喂饲对大鼠肝脏LCATmRNA、ACAT2mRNA的表达有显著影响。本实验首次发现珊瑚状猴头菌多糖对于大鼠肝脏卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)有调节作用，LCAT活性提高，可促使HDL2-C合成将外周组织的游离胆固醇转移至肝脏代谢。且LCAT的活性直接影响到机体内过剩胆固醇的清除速度。实验同时还发现，珊瑚状猴头菌多糖可以有效下调肝脏细胞内胆固醇酯化关键酶ACAT2mRNA的表达。

胆固醇酯化家族主要包括 ACAT1、ACAT2和LCAT[15]。ACAT2只在肝脏和小肠上皮细胞中表达，主要参与胆固醇的吸收和脂蛋白的装配。ACAT2是1种可被诱导表达的酶，主要分布于小肠上皮细绒毛顶端和肝脏细胞内，催化胆固醇与长链脂肪酸连接形成胆固醇酯。成年人的肝脏正常情况下ACAT2活性较低，ACAT2的作用是保护肝细胞免受过剩胆固醇的损害。ACAT2催化胆固醇酯合成主要与胆固醇吸收及乳糜微粒的合成有关， ACAT2在肝细胞中所提供的胆固醇酯与脂蛋白分泌有关[16]。ACAT2低活性对机体具有保护作用。有文献报道，ACAT2水平的调节对于脂质代谢非常重要，ACAT2被视为高胆固醇血症的一个重要靶标[17]。特异性抑制ACAT2，能有效地降低细胞内胆固醇酯的含量，且不会影响动物的正常生理功能。可阻止小肠对胆固醇的吸收和肝脏对胆固醇的酯化，降低血浆中胆固醇水平，预防和治疗AS。低密度脂蛋白被视为AS的主要危险因素，ACAT2具有调节胆固醇代谢及VLDL合成分泌作用[18]。

综上所述，珊瑚状猴头菌作为食品功能因子，是一种应用前景广阔的真菌，具有极为重要的医疗、营养保健等应用价值。体内胆固醇代谢异常是导致心血管疾病发生发展的重要原因之一，本实验表明，珊瑚状猴头菌多糖具有抗氧化作用，通过下调大鼠肝脏的ACAT2mRNA的表达和上调LCATmRNA的表达而具有显著的代谢调节作用，加上食用菌多糖几乎无毒副作用的特点，因此，珊瑚状猴头菌多糖也是一种新型高效安全的天然多糖制剂，可广泛应用于医药和保健食品的研制。

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Effect on Antioxidant and Regulation of Hepatic Metabolism in Rats ofHericiumcoralloidesPolysaccharide

TANG Peng1, LI Xue-ying1, WANG Da-zhong1, FENG Cui-ping2, HAN Ai-li2

(1.Zunyi Medical University, Department of Cell Biology and Genetics, ZunyiGuizhou563003; 2.Shanxi Agricultural University, College of Food Science and Engineering, JinzhongShanxi030801)

The effect of antioxidant and the expression of related genes in rat liver metabolism ofHericiumcoralloidespolysaccharide were explored. The rats were randomly divided into control group, intervention group and control group of polysaccharides. The control group was fed with basic feed, polysaccharide intervention group (dose group 1, dose group 2) and model group fed with high cholesterol diet, and polysaccharide intervention group (dose group 1, dose group 2) gave polysaccharide orally for 5 weeks, the rats were killed after 5 weeks of livers. Rat liver MDA content, superoxide dismutase (T-SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px), catalase (CAT) activity were measured. Real-time fluorescence quantitative PCR were used to detect the gene expression related to rat liver index: A acetyl CoA: cholesterol acyltransferase2 (ACAT2), lecithin cholesterol acyltransferase (LCAT). The results showed that compared with the model group, polysaccharide dose group 1 and group 2 doses of MDA content significantly decreased in rat liver(p<0.01), T-SOD activity increased significantly (p<0.01), GSH-Px activity increased significantly (p<0.01), and CAT activity was significantly improved (p<0.01). Liver gene expression index of polysaccharide dose group 1 and group 2, ACAT2 mRNA decreased significantly(p<0.01), and LCAT mRNA increased significantly (p<0.01). TheHericiumcoralloidespolysaccharide had significant antioxidant effect, which had regulatory effect on metabolism in rat liver.

Hericiumcoralloides; Polysaccharides; Cholesterol; Gene expression; Antioxidant capacity; Metabolism; Liver

*项目来源：山西省自然科学基金项目“姬松茸多糖对铅中毒大鼠免疫调节机理的研究”(2010011043-1)；山西省科技攻关项目“珍稀菇类姬松茸、茶薪菇、灵芝的研究开发和利用”(021025)。

唐鹏(1987-)，男，在读硕士研究生，主要从事生物药效学研究。E-mail：tpweb@126.com

**通信作者： 冯翠萍，教授，主要从事食品营养与安全研究。E-mail：ndfcp@163.com

2014-03-25

S646.9

A

1003-8310(2014)03-0048-04