凋亡相关基因PDCD5启动子区甲基化在新疆汉族和维吾尔族食管鳞癌中的作用研究

于 鹏，孙 伟，张国庆

（新疆医科大学附属肿瘤医院胸外科，乌鲁木齐 830011）

食管癌是世界上常见的恶性肿瘤之一。我国是食管癌发病率和死亡率最高的国家，且我国食管癌发病率具有明显的地域特点，新疆是我国食管癌高发省份之一。过去认为饮食和不良生活习惯与食管癌的发生密切相关，但却并不能完全解释食管癌发病过程中存在的明显地域、民族差异和高发区明显的家庭聚集现象［1－2］，提示遗传学等因素可能在食管癌的发生、发展中发挥重要作用。现在认为肿瘤的发生是因为肿瘤细胞脱离细胞对它的调控，导致其生长速度远远大于其发生凋亡的速度，最终的结果是细胞数量的过度积累，导致肿瘤的形成［3］。凋亡相关基因程序化细胞死亡分子5（PDCD5）是由北京大学人类疾病基因中心克隆得到的凋亡相关基因，许多临床常见肿瘤组织中检测到PDCD5表达下降，认为PDCD5表达降低可能与肿瘤的发生有关［4－5］。本研究探讨PDCD5启动子区CpG岛在新疆维吾尔族和汉族食管鳞癌中的甲基化情况，分析是否存在民族差异及其与临床病理特征的相关性。

1 材料与方法

1.1 临床资料 从新疆医科大学附属肿瘤医院标本库中选取2008年1月－2012年6月食管鳞癌患者术后标本40例，其中男性27例，女性13例，维吾尔族、汉族患者各20例（Ⅱ期、Ⅲ期各10例）。年龄56～69岁，中位年龄61岁。患者术前均未接受过放化疗及抗肿瘤治疗，术后病理证实为鳞癌。按照病例对照研究的要求，选取癌旁组织（距离癌肿距离＞5cm）作为对照。所有标本均于术后30min内获取，液氮速冻后－80℃冰箱保存。

1.2 主要试剂和仪器 DNA纯化试剂盒购自Thermo公司，甲基化试剂盒购自美国ZYMO research科技开发有限公司，甲基化引物由上海生工合成，高保真热启动酶购自德国凯杰公司。

1.3 方法

1.3.1 组织基因组DNA的提取 取20mg组织放于研钵中，在液氮中迅速研磨至粉末状，收集到1.5mL EP管中，加入20μL蛋白酶K和180μL组织消化液，置于56℃水浴锅中孵育3h，其余步骤严格按照说明书操作，提取的DNA用核酸蛋白分析仪测定浓度，A260／A280均应介于1.8～2.0，－20℃保存备用。

1.3.2 亚硫酸氢盐修饰基因组DNA 取20μL纯化的DNA，按照试剂盒说明书的步骤对DNA进行甲基化处理，用洗脱液对处理过的DNA进行回收，回收的DNA可立即进行下一步分析或－20℃短时间保存，若需长时间存放需置于－80℃冰箱。

1.3.3 甲基特异性PCR 扩增在 http：／／genome.ucsc.edu网站上查找基因启动子区序列，用CpG Island Searcher查找CpG岛，用Methyl Primer Express v1.0软件设计引物（表1）。

1.3.4 PCR反应体系 PCR取20μL体系 ，反应条件：10×PCR Buffer 2μL，dNTP Mix 0.5μL，引物A、引物B各0.5μL，Hotstartaq DNA Polymerase 0.2μL，模板 DNA 2μL，ddH2O 14.3μL。PCR反应温度：预变性95℃，15min；变性94℃，30 s；退火温度：（甲基化引物：53℃；非甲基化引物：49℃）；延伸：72℃，1min，共25个循环。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳30min，凝胶成像仪上观察电泳结果。

表1 PDCD5基因启动子区甲基化检测引物

1.3.5 结果判定 甲基化特异性引物扩增阳性者记为完全甲基化；甲基化特异性引物与非甲基化特异性引物扩增阳性者记为不完全甲基化，均视为甲基化阳性；非甲基化特异性引物扩增阳性者记为未甲基化。

1.4 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件包进行统计学分析，两组计数资料的比较采用χ2检验，相关性检验采用双变量关联性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PDCD5在食管鳞癌组织和癌旁组织中基因启动子区甲基化分析结果 癌组织中PDCD5启动子区甲基化阳性率为80.0%（32／40），其中3例发生完全甲基化，29例发生不完全甲基化。癌旁组织中甲基化率为35.0%（14／40），其中1例发生完全甲基化，13例发生不完全甲基化。癌组织与癌旁组织甲基化率差异有统计学意义（χ2＝16.57，P＜0.05）（图1）。

2.2 PDCD5在汉族和维吾尔族食管鳞癌患者中基因启动子区甲基化分析结果 汉族和维吾尔族食管鳞癌中PDCD5启动子区甲基化阳性率分别为90.0%（18／20）和70.0%（14／20），差异无统计学意义 （P ＞0.05）。

图1 MSP法检测PDCD5在不同组织中基因甲基化结果

2.3 PDCD5基因启动子区甲基化与食管鳞癌患者临床分期的关系 不同民族、性别、年龄食管鳞癌中PDCD5启动子区甲基化阳性率差异无统计学意义（P ＞0.05），与肿瘤的临床分期相关 （P ＜0.05），见表2。

表2 PDCD5基因启动子区甲基化情况与食管鳞癌临床分期的关系／例（%）

3 讨论

肿瘤的发生、发展是一个涉及多基因改变和多阶段的复杂过程，除DNA序列改变外，表观遗传学改变在其形成过程中也具有重要作用，其中DNA甲基化是研究最为深入的一种机制。DNA甲基化是最早被发现的表观修饰方式之一，也成为近些年来人们研究肿瘤发生机制的热点。

PDCD5定位于19号染色体，由6个外显子和5个内含子组成，全长约有6kb个基因。第25～399位基因阅读框编码125个氨基酸的蛋白质。赵杰等［6］对PDCD5基因上游区域的研究显示，在转录起始密码子之前有一个重要的转录起始点，由72个碱基对组成，其上游缺少TATA框和CAAT框。此区域具有极强的启动子活性，其中－555到－383区域与转录调节密切相关，而研究表明［6］在细胞凋亡过程中PDCD5基因可能是一些凋亡相关转录因子的靶向基因。许多临床常见肿瘤组织中检测到PDCD5表达下降。PDCD5的表达下降多与肿瘤组织凋亡信号抑制有关，并且在胃癌、卵巢癌、儿童恶性肿瘤［7－8］中检测到PDCD5基因表达产物下降，并且随肿瘤分级的升高，PDCD5蛋白下降更为明显。

本研究结果显示食管鳞癌组织中PDCD5基因启动子区甲基化阳性率为80.0%（32／40）高于癌旁组织的35.0%（14／40），差异有统计学意义，说明PDCD5启动子区甲基化与食管鳞癌的发生存在相关性。孙伟等［5］采用RT－PCR技术和免疫组织化学技术检测40例食管鳞癌组织和癌旁组织中PDCD5基因mRNA和蛋白的表达，发现食管鳞癌组织中PDCD5基因mRNA和蛋白的表达均低于癌旁组织，且差异具有统计学意义。本研究结果进一步显示食管鳞癌组织中PDCD5基因甲基化阳性率高于癌旁组织，结合表观遗传学的知识可以猜想可能是因为该基因启动子区高甲基化，导致该基因转录受阻，进一步影响到蛋白的表达。然而，目前尚无有力的证据能明确证实这一猜想，因此还有待于更多试验结果的支持。本研究结果显示PDCD5基因CpG岛的甲基化与患者的民族、性别、年龄无相关性，提示在新疆汉族和维吾尔族食管鳞癌的发生机制无差别，提示食管癌的发生主要涉及基因层面，至于新疆地区哈萨克族食管癌的发病率显著高于其他民族的原因可能是由于饮食及其他生活习惯造成的，提示肿瘤的发生是一种基因病，而环境因素是这一过程的始动因素。本研究显示癌组织与癌旁组织均存在一定数量的不完全甲基化个体，提示甲基化在食管鳞癌的发生过程中可能存在时间和剂量累积的过程，这就可以解释为什么生活在同一地区的人群而食管癌的发生率却不尽相同，其中肿瘤易感性是其中一个方面，而致癌因素的累积效应可能是另一方面。并且二者启动子区甲基化与临床肿瘤分期相关，分期高的甲基化程度相对较高，这一现象进一步验证了甲基化存在剂量和时间的累计这一假设。此结果与程雷等［9］和胡华梅等［10］的报道结果相一致。

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