桑枝中黄酮类的HPLC指纹图谱的研究

孙 莲, 严寒信, 姑再努尔·阿布力孜

(1新疆医科大学药学院化学教研室, 乌鲁木齐 830011； 2乌鲁木齐市61中学, 乌鲁木齐 830000)

桑枝(RamulusMori)是桑科桑属植物桑(MorusalbaL.)的一年生干燥嫩枝，是中医常用的传统药材，具有祛风活络、通利关节、燥湿利水之功效[1]。桑枝中的主要功效成分为黄酮类和生物碱类，现代药理学研究证明，桑枝黄酮具有抗炎、抗氧化、抗衰老、防癌、抗溃疡、解痉、抗菌、提高机体免疫功能以及降糖降脂等多种功能[2-8]。建立桑枝中黄酮类等物质指纹图谱分析对桑枝的质量控制十分必要[9-13]。本实验对10批次桑枝药材中黄酮类成分进行指纹图谱的分析，为新疆桑枝的质量控制和开发利用提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1仪器高效液相色谱仪(日本岛津，LC-20A)，二极管阵列检测器(日本岛津SPD-M10Avp)，KQ5200DE型超声波清洗器(昆山 40KHz 200W)。

1.2试药异槲皮苷对照品(上海晶纯医药科技发展有限公司，批号27988) ，紫云英苷对照品(上海融禾医药科技发展有限公司，批号 MUST-11092001)。乙腈、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。桑枝分别采自新疆乌鲁木齐、喀什市、疏勒县、昌吉、和田、阿克苏市、塔城、吐鲁番、哈密、伊犁地区，由新疆医科大学药学院生药教研室帕丽达·阿不力孜教授鉴定为桑的一年生干燥嫩枝(RamulusMori)。

2 方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：YMC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：A为0.1%的磷酸水溶液，B为0.2%的磷酸乙腈溶液，梯度洗脱：0 min(A-B，85∶15)，9 min (A-B，80∶20)，20 min (A- B，75∶25)，30 min(A-B，65∶35)，40 min(A-B，60∶40)；柱温30℃；流速1.0 mL/ min；检测波长360 nm；进样10 μL。上述色谱条件下的对照品及吐鲁番地区桑枝的色谱图见图1、2。

A: 异槲皮苷; B: 紫云英苷图1 对照品色谱图

A: 异槲皮苷; B: 紫云英苷图2 吐鲁番地区桑枝样品色谱图

2.2溶液的制备

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取紫云英苷及异槲皮苷各5.0 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得0.5 mg/mL的紫云英苷及异槲皮苷对照品储备液。

2.2.2 供试品溶液制备 精密称取10个地区的桑枝样品5.0 g(过60目筛，60 ℃干燥至恒重) ，置于250 mL三角瓶中，加30 mL石油醚，超声20 min(20℃水浴)，过滤，滤渣挥干溶剂后，转移到50 mL容量瓶中，加甲醇40 mL，于35℃时超提取40 min，4 000 r/min离心2 min，上清液移至50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，用时过0.45 μm的微孔滤膜。

2.3方法学考察

2.3.1 精密度试验 取同一份桑枝药材1份，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，在选定的色谱条件重复进样6次，记录色谱峰，计算各峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.2%～1.0% 和0.6%～2.0%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取同批桑枝药材5份，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，在上述色谱条件下分别测定，计算各共有峰相对保留时间RSD<1.1%,相对峰面积RSD<2.0%,表明方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 将上述制备的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件于0、2、8、16、24 h 测定，计算各色谱峰相对保留时间RSD<1.2%,相对峰面积RSD<1.6%,表明样品在24 h 内稳定性良好。

2.4桑枝药材指纹图谱的建立分别精密吸取不同产地供试品溶液10 μL进样，记录各批次图谱，图3为乌鲁木齐市桑枝图谱。发现11个特征峰是10批次桑枝所共有的，确定这11个峰为特征指纹峰。经与对照品图谱比较，确定其中6号峰为异槲皮苷，8号峰为紫云英苷，从图1中可知紫云英苷的分离度较好，保留时间适中，峰面积较大，因此选择8号峰(紫云英苷)作为参照峰(S峰)。10个不同产地桑枝药材指纹图谱叠图，见图4。

图3 桑枝药材对照峰的HPLC指纹图谱

图4 不同批次桑枝药材的HPLC指纹图谱

2.5相似度分析将10个不同产地桑枝的测试数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004年A版相似度软件，进行相似度的评价。结果表明，各样品相似度均>0.90，不同产地药材图谱具有很高的相关性，不同来源的桑枝主要成分基本相同，部分成分的相对含量存在差异(表1)。

表1 桑枝药材的相似度

3 讨论

3.1提取溶剂及提取方法的选择考察了水、不同浓度甲醇(60%、70%、80%、90%、100%)为提取溶剂在超声提取、索式提取及回流提取时的提取率，结果表明甲醇回流提取率最高。

3.2流动相的选择本研究比较了流动相为磷酸-乙睛和磷酸-甲醇系统时的色谱图，结果显示前者柱压较低，且进行梯度洗脱时，流动相比例的改变对其基线影响较小，分离度好。对以0.1%磷酸水溶液、0.2%磷酸水溶液、0.4%磷酸水溶液、甲酸水溶液为流动相的A相，乙腈、不同浓度的磷酸乙腈溶液为流动相的B相进行试验，结果表明，0.1%磷酸水溶液为A相和0.2%磷酸乙腈溶液为B相梯度洗脱时，药桑枝中的黄酮类成分分离得最好，峰形对称，指纹图谱结果稳定，重现性好。

3.3检测波长的选择采用二极管阵列对异槲皮苷及紫云英苷进行200～400 nm的紫外扫描，在360 nm及254 nm处有最大吸收，检测波长为360 nm时，峰数较多，分离较好，信号响应强度适当。故本实验选择360 nm作为药桑枝指纹图谱的检测波长。

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