骆驼刺中异鼠李素-3-O-β-D芸香糖苷对照品的制备研究

赛那瓦尔·芒思尔， 张 戈， 邹国安， 阿吉艾克拜尔·艾萨

(中国科学院新疆理化技术研究所，中国科学院干旱区植物资源化学重点实验室，省部共建新疆特有药用资源利用国家重点实验室培育基地， 乌鲁木齐 830011)

骆驼刺(AlhagisparsifoliaShap.)是豆科(Leguminosae)骆驼刺属植物，具有开通阻滞、止咳祛痰、消除异常黏液质等功效，用于治疗腹痛腹胀、痢疾腹泻、风湿等症[1]。骆驼刺提取物有抗氧化、抗病毒、抗菌、抗肿瘤、降糖等药理活性[2]。主要药效活性成分为黄酮苷类化合物，其中异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷的量较多。自身可通过抑制α-淀粉酶降低血糖，并能抑制淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒[3-4]。

骆驼刺为维吾尔医常用药材。但因长期以来缺乏质量控制用对照品，原药材和各种复方成药的质量控制问题未得到解决。本实验以骆驼刺为原料, 采用制备高效液相色谱等分离方法制备化学对照品异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷并进行标准物质研究, 为骆驼刺原药材及复方成药的质量控制奠定基础。

1 仪器与材料

戴安Ultimate TM3000系列液相色谱议包括LPG-3400RS泵系统、VWD-3100紫外检测器、WPS-3000自动进样器和TCC-3000RS柱温箱(Dionex, CAL. USA)，4000 QTRAP型三重四级杆-离子肼串联质谱仪(ABI, USA)，Waters 全自动纯化系统，2545型高压二元泵，2489型紫外检测器，3100型质谱检测器(Waters ,USA)。

色谱柱Inertsil ODS-SP, I.D.4.6 mm×250 mm, 4 μm (GL Sciences, Tokyo, Japan),旋转蒸发仪(Buch, SHZ-D),电子天平 (SEJ180-4)。色谱柱及薄层色谱板均为烟台江友硅胶开发有限公司产品， 甲醇、乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其余试剂为分析纯。

骆驼刺药材2008年8月购买于新疆托克逊县，经中国科学院新疆生态与地理研究所生物标本馆沈观冕研究员鉴定为豆科骆驼刺属植物骆驼刺(AlhagisparsifoliaShap.)。

2 方法与结果

2.1原料处理取骆驼刺草药材3 kg, 95%乙醇回流提取3次, 每次1 h, 合并醇提液, 减压浓缩至浸膏状(271 g), 加水混悬, 分别用石油醚、氯仿、乙酸乙醇及正丁醇萃取, 取正丁醇部位浓缩成浸膏(121 g), 加硅胶拌样, 上样于硅胶柱(200～300 目), 依次用氯仿-甲醇(90∶10～70∶30)、氯仿-甲醇-水(70∶30∶10～60∶40∶10)梯度洗脱，取氯仿-甲醇-水(70∶30∶10～60∶40∶10)的洗脱流份上样于sephadex LH-20 柱, 甲醇洗脱, 合并黄酮苷富集流份，待制备行高相液相进一步分离。

2.2色谱条件

2.2.1 制备型高效液相色谱条件 Waters C18 sunfireTM(300 mm× 25 mm, 6 m)，流动相为乙腈∶水(13∶87)，体积流量20 mL/min， 检测波长254 nm，进样量300 μL( 5 mg/mL,MeOH) 。

2.2.2 对照品的制备分离 取异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷粗品加甲醇配制成5 mg/mL 的溶液, 制备高效液相色谱法多次进样分离纯化, 每次进样量为300 μL, 收集保留时间为70 min 色谱峰(制备HPLC色谱图见图1), 减压回收至干后置恒温干燥箱(60℃)干燥10 h, 得到黄色无定性粉末。

图1 乙腈-水13∶87为流动相比例分离图谱

2.3样品的检测

2.3.1 薄层色谱检测 取异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷自制品, 加甲醇配制成2 mg/ mL 的溶液, 点样量分别为20 μg(点1)、40 μg(点2)、60 μg(点3)、80 μg(点4)，浓度依次增加，点样于硅胶G 薄层色谱板，以15%硫酸乙醇溶液为显色剂，其中硅胶G 薄层色谱展开剂分别为:氯仿-甲醇-水( 7∶3∶0.5)(图2a)和丙酮-乙酸乙酯-水(8∶3∶1)(图2b)，紫外光灯( 254 nm) 下检视,在2种展开系统中均见单一黄色主成分斑点, 无杂质斑点。比移值分别为0.37和0.61。

2a 2b

2.3.2 HPLC-UV检测 取异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷制品, 加甲醇配制成1 μg/mL 的溶液, Waters sunfireTM C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm), 流动相为乙腈∶水(80∶20),体积流量为1 mL/min，检测波长为254 nm， 进样量为10 μL条件下面积归一化法定量分析, 结果自制品的质量分数为99.01%, HPLC-UV百分含量检查图谱见图3。

图3 异鼠李素-3-O-芸香糖苷对照品HPLC谱图

2.4结构确定异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷为黄色粉末，易溶解于四氢呋喃，微溶于甲醇、水,难溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于石油醚。光谱分析结果如下：UVλMeOH max(logε)∶255 nm (1.15), 360 nm (0.83)， IR νmax cm-1:3 382，1 654，1 602，1 503，1 453。MS ESI-MSm/z(%):ESI-MS[M-H]-623。异鼠李素-3-O-芸香糖苷对照品化学结构见图4。自制异鼠李素-3-O-芸香糖苷1H-NMR，13C-NMR信息和文献报道的异鼠李素-3-O-芸香糖苷的1H-NMR、13C-NMR谱图对比，结果一致(表1、2)。因此，推断该化合物的分子式为C28H32O16。

图4 异鼠李素-3-O-芸香糖苷对照品化学结构

表1 异鼠李素-3-O-芸香糖苷的1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6)数据归属

表2 异鼠李素-3-O-芸香糖苷的13C-NMR(600 MHz,DMSO-d6) 数据归属

3 讨论

初步的药理实验研究亦表明，异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖是骆驼刺的主要有效成分之一，其事实上也是草本植物中分布普遍、比较常见的黄酮双糖苷类化合物。本课题组选择异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷为本植物特征性指标成分并进行标准物质研究, 专属性较强, 具有质量控制意义。采用硅胶富集结合凝胶柱色和制备高效液相从骆驼刺中制备异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷，样品损失少，方法简单，可快捷有效地得到异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷对照品，为骆驼刺药材和复方制剂质量控制及药效物质基础研究奠定基础；为实现维吾尔药的现代化及与国际市场接轨服务，由此带来可观的社会效益和经济效益。

参考文献：

[1] 李君山，刘勇民，蔡少青. 维吾尔医用骆驼刺类药材的资源、商品流通及民间应用研究[J]. 中国民族医药杂志, 1996, 2(2):39-40.

[2] 张贵杰，李宁，倪慧，等. 骆驼刺属植物的化学成分与生物活性[J]. 国外医药:植物药分册, 2008, 23(4):157-160.

[3] 苏小川，黄昀，赵永昕，等. 骆驼刺中黄酮类化合物的提取工艺研究[J]. 时珍国医国药, 2009, 20(6):1333-1334.

[4] 时永杰. 疏叶骆驼刺[J]. 中兽医医药杂志,2003，(S1):140-141.

[5] 刘墨祥，郑毅男，刘日月，等. 旱柳叶中异鼠李素-3-芸香糖甙和咖啡酸的分离与鉴定[J]. 吉林农业大学学报, 1998, 29(1):9-12，22.