番茄酱灌胃大鼠粪便中番茄红素的提取工艺研究

石骁昵， 张 俊

(1乌鲁木齐市疾病预防控制中心， 乌鲁木齐 830026； 2新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心， 乌鲁木齐 830002)

新疆是番茄生产大省，我国90%以上的番茄产地在新疆，而且番茄的制品也较多，其中番茄酱是主导产品。由于新疆气温低、日照时间长，所以番茄中的番茄红素含量很高，可达到80 mg/100 g，有些甚至超过100 mg/100 g，远远高于其他地区出产的番茄(番茄红素平均含量13 mg/100 g)[1]。番茄红素是一种脂溶性不饱和碳氢化合物，属类胡萝卜素，与β-胡萝卜素是同分异构体。目前的研究认为，番茄红素在预防人类疾病和维持人体健康方面起着重要的作用，可预防高血压[2]、骨质疏松症[3]、心血管疾病[4]的发生，对前列腺癌[5]及老年痴呆[6]等也可能有一定的防护作用，因此番茄红素成为了食品和医药领域的研究热点。

目前，国内外科学工作者对番茄红素的研究报道主要集中在番茄红素的提取和制备、基础及药理研究等方面[7-9]，但涉及番茄红素的体内消化吸收和剂量安全性方面的研究报道则相对较少。根据目前的研究推测,未被吸收的番茄红素主要通过粪便排泄[10]。本研究以新疆地产番茄酱为原料，对大鼠进行灌胃试验，收集其粪便，对其中的番茄红素残留进行分析检测，旨在建立动物粪便中番茄红素的提取方法，对后续探讨番茄红素在动物体内的消化吸收程度提供理论依据；同时有利于番茄红素制备产业的生产实践，对提高番茄红素产品的效能、降低成本、增长效益有重大意义。

1 材料与方法

1.1材料与仪器SD大鼠购于新疆维吾尔自治区疾病预防与控制中心。番茄酱(新疆屯河番茄酱厂，番茄红素含量60 mg/100 g，批号20130921)，甲醇(天津致远化学试剂公司，批号20120612)，乙酸乙酯(重庆扬子江乙酰化工有限公司，批号20120135)，苏丹红I色素(上海思域科技化工有限公司，批号20110325)。

JY2002子天秤(余姚市金诺天平仪器有限公司)，TD5A-WS台式低速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)，724紫外分光光度计(上海博讯实业有限公司)，DZF-6090真空干燥箱(上海一恒科技有限公司)，HHS型电热恒温水浴锅(上海博讯实业有限公司)，代谢笼(由新疆维吾尔自治区疾病预防与控制中心自制)，离心管，5 mL注射器，16号灌胃针。

1.2大鼠分组及饲养方法选取体质量为150～200 g 的SD大鼠20只，根据性别随机分成两组(每组10只,雌雄对半)：即试验Ⅰ组：色拉油灌胃对照组；试验Ⅱ组：番茄红素含量为0.006%的番茄酱灌胃组。各组分群饲喂, 每天灌胃1次, 灌胃剂量按体质量每100克灌胃1 mL，自由采食和饮水。预饲喂3 d后将SD大鼠分别放至代谢笼中，编号进行单独饲喂。

1.3灌胃方法大鼠置于大鼠盒内,使大鼠处于自然的站立状态。大鼠固定好之后,右手持灌胃器, 从大鼠左(或右)嘴角进针,灌胃针进入深度为5 cm 左右时,右手食指轻推注射器使药液缓慢进入大鼠胃内。

1.4粪便的收集、保存及处理在消化代谢试验中，于每天12点，灌胃完毕后收集前1天的粪便，将粪便样品采用60℃真空干燥3 h后，称重避光保存。

1.5测定方法

1.5.1 标准曲线的绘制 准确称取0.025 g苏丹红Ⅰ色素(分析纯)，用少量无水乙醇溶解，定量移入50 mL容量瓶中，并用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，浓度为50 μg/mL。准确吸取标准溶液0.26、0.52、0.78、1.04、1.30 mL，分别注入两组50 mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即相当于0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 μg/mL番茄红素标准溶液浓度。然后，依次注入1 cm比色皿中，在番茄红素最大吸收波长下(475 nm)，以无水乙醇为空白溶液，分别测定吸光度。以测得的吸光度为纵坐标，苏丹红Ⅰ色素标准溶液所相当的番茄红素浓度为横坐标，绘制标准曲线或者建立线性回归方程。

1.5.2 样品的检测 取提取液注入比色皿中，按照“1.5.1”项下的方法在475 nm波长下使用紫外分光光度计分别测定吸光度。

1.6最佳提取溶剂的选择准确称取一定量的粪便试样，分别加入乙醚、丙酮、正己烷、乙酸乙酯4种不同的提取剂中。在相同条件下浸提，滤出提取液冷却至室温后，用上述“1.5.1”项下方法测其吸光度[11]，根据实验结果进行综合比较后确定最佳的提取溶剂。

1.7最佳提取方法单因素试验设计设计4个单因素试验，考察不同液料比、不同提取时间、不同提取温度及不同提取次数与粪便中番茄红素提取率的关系，为确定最佳番茄红素提取工艺参数提供依据。

1.8最佳提取方法正交试验设计据单因素试验的结果及有关资料介绍，确定以液料比、提取时间、提取温度及提取次数4个因素进行的四因素三水平正交试验设计，正交试验因素水平表,见表1。

表1 大鼠粪便中番茄红素提取正交试验设计

2 结果

2.1番茄红素标准曲线的绘制确定了以苏丹红Ⅰ色素为标准品的番茄红素测定标准曲线方程为Y=1.778X+0.021 3，r2=0.998 7，其中Y为475 nm下的吸光度值；X为番茄红素浓度(μg/mL),见图1。

图1 番茄红素的标准曲线

2.2大鼠粪便中番茄红素提取最佳工艺的确定

2.2.1 单因素试验结果

2.2.1.1 不同提取剂对番茄红素提取率的影响 以正己烷、丙酮、乙酸乙酯、乙醚分别作为提取剂时，相同检测条件下，吸光度值分别如图2所示。正己烷、丙酮、乙醚作为提取剂时，吸光度值约为0.3；乙酸乙酯作为提取溶剂时，吸光度值>0.4，故选择乙酸乙酯为最佳提取剂，见图2。

图2 不同提取剂对番茄红素提取率的影响

2.2.1.2 不同液料比对番茄红素提取率的影响 随着液料比的增大，番茄红素提取率呈上升趋势，当液料比>4∶1时，提取率略微增加，故液料比选择4∶1，见图3。

图3 不同液料比对番茄红素提取率的影响

2.2.1.3 不同提取时间对番茄红素提取率的影响 随着提取时间的延长，番茄红素提取率逐渐增大，提取时间为30 min时提取率达到最大值，随后提取率略微下降，故提取时间选择30 min，见图4。

图4 不同提取时间对番茄红素提取率的影响

2.2.1.4 不同提取温度对番茄红素提取率的影响 随着提取温度的增大，番茄红素提取率逐渐增大，提取温度达35℃时提取率最高，随后提取率略微下降，故提取温度选择35℃，见图5。

图5 不同提取温度对番茄红素提取的影响

2.2.1.5 不同提取次数对番茄红素提取率的影响 随着提取次数的增加，番茄红素提取率略微增大，提取次数达3次时提取率最高，故提取次数选择3次，见图6。

图6 不同提取次数对番茄红素提取率的影响

2.2.2 正交试验结果 根据单因素试验结果,分别选择液料比、提取时间、提取温度及提取次数4个因素进行正交试验。由表2极差分析可知，影响提取率的主要因素为液料比(A)、提取时间(C)、提取温度(D)以及提取次数(B)，即液料比>提取次数>提取时间>提取温度；最佳提取条件为A2B2C2D3，即液料比为4∶1(mL/g)，提取时间为40 min，提取温度35℃，提取次数3次,见表2。

表2 大鼠粪便中番茄红素提取工艺正交试验结果

3 讨论

大鼠粪便中番茄红素提取的最佳提取剂为乙酸乙酯，操作条件为液料比为4∶1、提取时间40 min、提取温度35℃、提取次数3次,在此条件下番茄红素的提取率可达84%以上。

本研究建立了动物粪便中番茄红素的提取初步方法，对液料比、提取时间、温度、次数都进行了比较和阐述。对大鼠粪便中的番茄红素的检测方法，确定以苏丹红Ⅰ色素为标准品，回归方程为Y=1.778X+0.021 3，r2=0.998 7。回收率>85%以上。符合检测要求。

采用本方法，完全可以满足番茄红素在动物体内表观消化率研究的需要；但是，番茄红素在室温下极易氧化分解，在灌胃及粪便中番茄红素检测过程中，如保护不当，会导致较大的误差，因此如何能更加有效地灌胃及更加快捷地检测番茄红素含量还需要进一步研究。

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