黄芪多糖对心肌缺血再灌注损伤的保护作用*

李铁成，张静峰，马宝丰，徐 芳，李德生，艾 浩

（辽宁医学院附属第三医院，锦州 121000）

黄芪多糖（APS）是中药黄芪的主要有效成分之一，具有调节免疫活性，抗炎抗氧化，减轻恶性肿瘤化疗后的骨髓抑制等药理作用[1-2]。近年研究发现黄芪多糖对心血管疾病具有一定的保护作用，其对糖尿病心肌病和心肌肥厚有一定的改善作用[3-4]。进一步研究显示黄芪多糖对心肌缺血损伤也有一定的保护作用[5]。对心肌缺血再灌注损伤的深入研究发现，炎症因子以及炎症信号通路在心肌缺血再灌注损伤上发挥着至关重要的作用[6]，因此本研究以炎症信号通路及炎症因子为切入点，采用大鼠左冠状动脉结扎的缺血再灌注模型，进一步探讨了黄芪多糖对缺血再灌注损伤心肌的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级成年雄性SD大鼠48只，体质量（220±40）g，由辽宁医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（辽）2009-0004。

1.2 药品与试剂 黄芪多糖，南京景竹生物科技有限公司，批号：JZ131209A；IκBα、p65 一抗：北京博奥森生物技术有限公司；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）ELISA 检测试剂盒：研域（上海）化学试剂有限公司。

1.3 分组与给药 将48只SD大鼠按随机数字表法随机分为假手术组（Sham组）、心肌缺血再灌注组（MI/R组）、黄芪多糖低剂量组（300 mg/kg），黄芪多糖高剂量组（600mg/kg）。假手术组只穿线不结扎，MI/R组结扎30min，再灌注120min。本实验根据以往研究结论[7-8]和预实验结果采用了300 mg/kg和600 mg/kg黄芪多糖于造模前7 d灌胃给予，1次/日。

1.4 方法

1.4.1 模型制备 大鼠术前12 h禁食不禁饮，20%乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠，气管插管，接人工呼吸机（频率55次／分，潮气量15 mL/kg），四肢皮下插入针型电极记录心电图，并接心电监护仪监测心电变化。在胸骨左缘2、3肋间开胸，暴露心脏，剔除心包，于肺动脉圆锥和左心耳之间距主动脉根部1 mm处找到左冠状动脉，稳定10 min后，用剪去一条的细塑料管并行血管套于血管处，用3-0无创伤缝合线结扎套有塑料管的冠状动脉，30 min后，用眼科剪刀剪去结扎线，移去管垫，再灌注120 min后取材测指标[9-10]。结扎后心电图ST-T抬高，放松后ST-T回落50%为造模成功标志。

1.4.2 HE染色 再灌注后取下心肌组织置于10%甲醛液中保存48 h。固定脱水，石蜡包埋，连续切片，片厚 5 μm，60 ℃烤片，伊红，苏木素染色封片[11]，正置显微镜下拍照。

1.4.3 心肌梗死范围测量 再灌注后取出心脏，切去心房及右心室，放入冰箱速冻1 h，在冠脉结扎线下平行于冠状沟将心室等厚切成5片，放入0.1%氯化硝基四氮唑蓝（NBT）溶液中，于37℃恒温水浴振摇染色10 min。正常心肌染色为暗蓝色，梗死区心肌不着色为浅红色，用4%的多聚甲醛固定,分开梗死区与非梗死区心肌,计算梗死面积百分比。梗死面积%＝（梗死区心肌质量/整个左心室质量）%。

1.4.4 ELISA检测血清TNF-α和IL-6含量 大鼠颈动脉取血，离心后收集上层血清，按试剂盒说明书操作测定血清中TNF-α和IL-6含量。

1.4.5 IκBα、p65蛋白表达的检测 取部分梗死区心肌组织，用PBS冲洗，置于－70℃冰箱备用。测定指标时，取出样品，BCA法蛋白定量。然后每组取10 μL样品以及蛋白标准物点样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，初始电压为90 V，观察Marker的移动情况，适时终止电泳。转膜、封闭、洗膜，切割后分别与其特定的稀释过的IκBα、p65一抗4℃杂交过夜，用洗膜液洗膜3次后与稀释过的二抗反应，摇床上杂交1 h，再次洗膜3次，加ECL显色，化学发光凝胶成像系统检测。

1.4.6 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件进行数据统计，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同处理因素对心肌形态学变化的影响 假手术组心肌组织肌纤维排列整齐，无凋亡和炎性细胞侵润的形态学变化。模型组心肌组织肌纤维排列紊乱，部分出现断裂，有少量炎性细胞浸润。而高剂量黄芪多糖组可部分改善上述心肌组织的形态学变化。见图1。

2.2 心肌梗死面积结果 与缺血组相比，黄芪多糖低剂量组可缩小心肌组织的梗死面积，而黄芪多糖高剂量组心肌组织梗死面积进一步减小。见表1。

表1 各组大鼠心肌梗死面积结果（±s）Tab.1 Myocardial infarct sizes in each group（±s）

表1 各组大鼠心肌梗死面积结果（±s）Tab.1 Myocardial infarct sizes in each group（±s）

注：与 Sham 组比较，**P＜0.01；与 MI/R 组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别Sham组MI/R组黄芪多糖低剂量组黄芪多糖高剂量组n6666剂量（mg/kg） 梗死面积（%）-1.36±0.0840.98±6.63**300 32.13±4.14#600 26.23±3.86##-

2.3 黄芪多糖对大鼠血清TNF-α和IL-6含量的影响 如表2所示，心肌缺血再灌注损伤时大鼠血清中TNF-α和IL-6含量显著增加，黄芪多糖可不同程度的降低上述炎症因子的增加。

图1 心肌组织形态学变化Fig.1 Morphological changes in heart tissue of different groups

表2 黄芪多糖对TNF-α和IL-6含量（±s）Tab.2 Effects of APS on TNF-α and IL-6 content（±s）ng/L

表2 黄芪多糖对TNF-α和IL-6含量（±s）Tab.2 Effects of APS on TNF-α and IL-6 content（±s）ng/L

注：与 Sham 组比较，**P＜0.01；与 MI/R 组比较，##P＜0.01。

组别Sham组MI/R组黄芪多糖低剂量组黄芪多糖高剂量组n 6 6 6 6剂量（mg/kg）--300600 TNF-α 25.7±4.2154.8±8.6**105.3±4.9##60.8±9.7##IL-659.8±6.3148.8±6.6**110.6±8.3##89.8±9.7##

2.4 黄芪多糖对心肌组织IκBα、p65蛋白表达的影响 缺血再灌注损伤时，IκBα表达降低，而p65表达增加，提示缺血再灌注损伤时有NF-κB通路激活。黄芪多糖预处理可降低p65表达而增加IκBα表达，表明黄芪多糖对心肌缺血再灌注损伤激活的NF-κB有一定的抑制作用。见图2。

图2 IκBα、p65蛋白表达Fig.2 Protein expression of IκBα and p65

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤是导致心肌急慢性损伤的重要病理生理过程，虽然这一复杂病理生理过程的机制还不是很明确，但大量研究显示炎症反应在这一过程中发挥了重要作用。核转录因子-κB（NF-κB）是一种具有基因转录多向调控作用的核转录因子。NF-κB最常见的是由p65与p50或p52组成的同源或异源二聚体，生理条件下，IкBα通过其特征性锚定蛋白与NF-кB二聚体结合，掩盖其核定位信号，从而抑制NF-кB活性[12]。缺血再灌注损伤时IкBα蛋白降解，与NF-кB解离，使其活化。NF-кB的活性增加可使炎症因子如TNF-α，IL-6等释放[13]。TNF-α的释放增加可降低心肌收缩性，降低血压，促进中性粒细胞黏附等，加重炎症反应发生，使缺血的心肌损伤进一步恶化[14]，因此抑制NF-кB活化，抑制炎症反应对心肌缺血在灌注损伤具有重要意义。

本研究发现在缺血再灌注损伤发生后，炎症因子表达增加，p65表达增加，而IкBα表达降低，证实了上述说法。黄芪多糖预处理后改善了心肌组织的形态学变化，降低心肌梗死面积，提示黄芪多糖对缺血再灌注损伤的心肌有一定的保护作用。进一步研究显示黄芪多糖在改善缺血再灌注损伤的同时，降低了缺血再灌注损伤所致的TNF-α，IL-6含量增加，抑制了p65蛋白表达增加，增加了IкBα蛋白表达，提示黄芪多糖对缺血再灌注损伤的保护作用可能是通过抑制NF-кB，进而抑制炎症反应相关。本研究结果进一步证实了黄芪多糖对缺血再灌注心肌的保护作用，为中药黄芪的开发提供了参考。

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