GC-MS法测定猪肉样品中盐酸克伦特罗残留

李莺，王毅红，王亮，李婵君

（郑州市农产品质量检测流通中心，郑州 450006）

GC-MS法测定猪肉样品中盐酸克伦特罗残留

李莺，王毅红，王亮，李婵君

（郑州市农产品质量检测流通中心，郑州 450006）

建立了乙酸乙酯提取、SCX小柱净化、GC-MS分析、外标法定量的猪肉样品中盐酸克伦特罗残留的检测方法。盐酸克伦特罗在10.24～512.0 ng／mL的范围内线性关系良好，相关系数r=0.999 7。在1.92，5.12，12.80 μg／kg添加水平下的回收率为73.0%～84.8%，测定结果的相对标准偏差为4.3%～8.2%（n=6）。2日间3浓度点的日间平均回收率在77.1%～81.2%之间，相对偏差在1.3%～5.3%之间。该方法简便、快速，精密度和准确度较好，能满足日常大批量猪肉样品中盐酸克伦特罗残留的检测要求。

气相色谱-质谱法；盐酸克伦特罗；猪肉样品；方法比较

瘦肉精不是饲料，也不属于饲料添加剂，而是一类叫做β-兴奋剂的药物。在猪的养殖中大剂量使用瘦肉精能显著提高猪肉瘦肉率。瘦肉精经食物链被人食用后人体会受到损害，严重时会引发中毒。这种药物的滥用问题至今依然是全社会普遍关注的食品安全热点之一。

近年β-兴奋剂药物盐酸克伦特罗、莱克多巴胺的检测均有报道［1-3］。莱克多巴胺属于苯酚型结构，在猪体内与葡萄糖甘酸结合，检测中需在提取前后用酶水解约12～16 h［4～5］。而克伦特罗属于苯胺型结构，在猪体内以游离态存在，水解前后结构无明显区别［6］。若要实现克伦特罗与莱克多巴胺的同时检测，需用较长时间进行水解，会增加前处理的时间。另外莱克多巴胺毒性低，在体内代谢快速，不易产生严重的累积残留［3］，且现今为止发生的瘦肉精事件都是由克伦特罗药物引起中毒的。因此通常情况下，对盐酸克伦特罗的单独、快速检测依然是基层检测工作者必备的技能。

目前对于动物组织样品中单独针对盐酸克伦特罗的定量检测，现行的标准有GB／T 5009.192-2003和NY／T 468-2006，两标准推荐的样品前处理步骤及上机采集离子都不相同，这就给检测方法的选择和建立造成了困惑。笔者分别依照两个标准展开实验，对两标准各自推荐的样品提取方法和净化方法进行了实验比较、讨论和检测结果比对，并且对两标准中各自推荐的采集离子进行了监测选择，对两标准进行优化、整合，建立了快速、可靠、适合日常检测工作的GC-MS分析方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

气相色谱质谱联用仪：GCMS-QP2010型,日本岛津公司；

电子天平：JM-B3002型（余姚市纪铭称重校验设备有限公司），XP-204型（梅特勒-托利多公司）；

SCX强阳离子交换小柱、WCX弱阳离子交换小柱：500 mg／3 mL，美国色谱科公司；

针筒式微孔过滤膜：0.45μm，水相，天津市津腾实验设备有限公司；

甲醇、乙酸乙酯、异丙醇：色谱纯，美国J. T. Baker公司；

甲苯：色谱纯，天津化学试剂研究所；

碳酸钠、盐酸、氢氧化钠、氨水、磷酸二氢钠、氯化钠、高氯酸：分析纯；

双（三甲基硅基）三氟乙酰胺（BSTFA）：美国色谱科公司；

盐酸克伦特罗标准品：纯度为98.5%，德国Dr. Ehrenstorfer公司；

实验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱：DB-5MS 5%苯基-甲基聚硅氧烷石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气：高纯氦（纯度为99.999%），流速为1 mL／min；进样口温度：240℃；柱温：初温70℃，保持1 min，以18℃／min升至200℃，再以5℃／min升至245℃，以25℃／min升至280℃，保持2 min；进样体积：1 μL；不分流进样。

1.2.2 质谱条件

EI源；电子能量：70 eV；源温：200℃；接口温度：260℃；容积延迟：3.5 min；测定方式：离子监测（SIM）；监测范围：11.75～12.75 min；监测离子：m／z 86，187，243，262。

1.3 样品前处理

1.3.1 提取净化

依照NY／T 468-2006，称取（5±0.05）g猪肉样品于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入3 mL 10%碳酸钠溶液，匀浆提取后离心，收集上层有机相，再向样品中加入10 mL乙酸乙酯涡旋混合后离心，收集并合并提取液。在收集的提取液中加入5 mL 0.1 mol／L的盐酸溶液，涡旋混合后离心。吸取下层水相，重复萃取一次，合并萃取液，用NaOH溶液调节pH值为4.5。

以上样品液经SCX小柱净化，依次用5 mL甲醇、5 mL水和5 mL 30 mmol／L盐酸活化，萃取液上柱，以5 mL水和5 mL甲醇淋洗，抽干小柱，再用5 mL 4%的氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，完成对样品的提取和净化过程。

1.3.2 衍生化

将1.3.1得到的样品液，置于60℃水浴中氮气吹干，加入200 μL甲苯和100 μL BSTFA，迅速加盖，涡旋30 s后，置于80℃的烘箱中衍生1 h，待冷却后加入200 μL甲苯，涡旋混匀。进行GC-MS分析。

2 结果与讨论

2.1 提取方法的选择

盐酸克伦特罗含苯胺取代基，在酸性条件下，以离子态存在，易溶于水溶液；在碱性条件下，以游离态存在，易溶于有机溶剂［9］。GB／T 5009.192-2003与NY／T 468-2006两标准中的提取方法正是代表了这两种不同的情况。

NY／T 468-2006样品预处理方法即前述1.3.1步骤，即先在碱性条件下用有机试剂提取，再利用稀酸萃取，同时完成除脂、除蛋白。而GB／T 5009.192-2003是先用酸溶液提取，同时完成去脂、去蛋白，再在碱性环境下利用有机相振荡萃取后浓缩。具体过程：将样品在0.1 mol／L的高氯酸溶液中匀浆，并经80℃水浴超声提取，提取样液用NaOH溶液调pH值到9.5后，加盐并用异丙醇-乙酸乙酯（4∶6）进行振荡萃取，浓缩有机相后，用磷酸二氢钠缓冲溶液溶解残留物，经针筒滤膜过滤待净化，完成对样品的提取过程。

试验发现，GB／T 5009.192-2003的提取方法在有机试剂振荡萃取过程中易出现乳化，之所以出现这种情况，应该是有些样品中蛋白含量较高，经高氯酸溶解，辅以超声、加热处理后仍有部分蛋白残留于提取液中，而后在强碱条件下沉淀析出，从而在振荡萃取过程中发生了乳化现象。此外，该方法使用的实验器皿多、试剂品种多且用量大，步骤繁琐、耗时长，完成10个样品的提取过程用时约14 h。而前述1.3.1部分的提取方法在萃取过程中不会出现乳化现象，且使用的实验器皿少，试剂相对简单，用量也少，完成10个样品的提取过程用时约3 h，大大提高了检测效率。

2.2 净化小柱的比较

GB／T 5009.192-2003和NY／T 468-2006两标准分别用WCX和SCX做净化小柱。WCX与SCX都是阳离子交换柱，采用乙醇／甲醇活化，水、上样液溶剂平衡，上样，再以水、乙醇／甲醇淋洗，最后用氨化乙醇／氨化甲醇洗脱的通用净化方法对两种SPE小柱的保留效果进行了比较。试验发现，样品液经WCX小柱上样后用水、乙醇淋洗，分别收集淋洗液，处理并吹干、进行衍生化，上机进样，有目标物盐酸克伦特罗检出，且水淋洗的检出量大于乙醇淋洗的结果，说明WCX小柱对盐酸克伦特罗的保留效果不好，这一点在文献［10］中也被提到。同时对SCX小柱进行考察，未发现在上样、淋洗过程有目标物损失的情况，实验效果良好，可获得较为满意的结果。

2.3 采集离子的选择

采用SIM方式对GB／T 5009.192-2003和NY／T 468-2006提供的6个监测离子m／z 86，187，243，262，212，277进行扫描，得到盐酸克伦特罗标准品衍生物的选择性离子质谱图，如图1所示。选用离子丰度最大的碎片m／z 86作为定量离子，丰度较大的m／z 262，243，187作为定性离子。

图1 盐酸克伦特罗标准品（256 ng／mL）衍生物的选择离子质谱图

图2为步骤1.2的仪器条件下，空白猪肉样品中添加盐酸克伦特罗的总离子流图和碎片离子流图，目标物出峰时间为12.137 min，总离子流图和各监测离子流图均未见干扰峰。

2.4 标准工作曲线

图2 添加浓度6.40 μg／kg盐酸克伦特罗的总离子流图（a）及各监测离子流图（b）

取一定量的盐酸克伦特罗标准品，用甲醇溶解，配制成质量浓度为400 mg／L的标准储备液，再稀释成一定浓度的中间标准溶液，分别吸取一定体积到10 mL离心管后，按步骤1.3.2进行衍生，得到浓度分别为10.24，19.20，32.00，51.20，128.0，256.0，384.0，512.0 ng／mL的标准工作液系列，依次进行GC-MS采集，每点各进样3针。

以定量离子（m／z 86）峰面积（A）对相应质量浓度（ρ，ng／mL）进行线性回归，得回归方程为A=687.5526ρ-663.754 9，相关系数r=0.999 7，表明线性关系良好。

2.5 方法回收率及检出限

利用在空白样品中添加标准溶液的方法，按步骤1.3的样品前处理方法对猪肉组织中盐酸克伦特罗分别进行1.92，5.12，12.8 μg／kg 3水平的添加回收试验，每个浓度点进行6个平行样的同批次重复性检验及2个随机日的日间重复性来考察检测方法的稳定性，结果如表1所示。

表1 猪肉样品中不同添加水平下盐酸克伦特罗的回收率、相对标准偏差（n1=6）及2日间重复性（n2=2）

由表1可知，分2日检测的猪肉组织样品中盐酸克伦特罗3浓度点添加回收率在73.0%～84.8%之间，相对标准偏差在4.3%～8.2%之间。2日间3浓度点日间平均回收率分别为77.1%，81.2%，78.9%，相对应的日间相对偏差分别为5.3%，4.5%，1.3%。

在本实验条件下，空白猪肉样品中添加量为1.00 μg／kg时信噪比S／N＞3；添加量＜1.00 μg／kg时，背景干扰影响较大，定量离子的准确积分较困难。因此本方法的检出限为1.00 μg／kg。

3 结语

对 标 准GB／T 5009.192-2003，NY／T 468-2006中提出的酸提取和乙酸乙酯提取方案、WCX和SCX小柱净化方案进行了系统的比对研究，并对两标准在实际检测工作中的资源利用、工作时效、检测可靠性进行了分析，确定了碱性乙酸乙酯提取-稀盐酸反萃取-SCX小柱净化-BSTFA衍生-SIM扫描（M／Z 86，262，243，187）-外标法定量相结合的检测方案。该方法简便、快速、可靠性较好，适用于日常对猪肉样品中盐酸克伦特罗检测的定性、定量工作。

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Determination of Clenbuterol Residue in Pork by GC-MS

Li Ying, Wang Yihong, Wang Liang, Li Chanjun
（Testing Center for Quality of Agricultural Products, Zhengzhou 450006, China）

Extracted with ethyl acetate, purified with SCX cartridge, quantified by external standard, a method was established for the determination of clenbuterol in pork by GC-MS. The good linearity was showed in the range of 10.24-512.0 ng／mL with the correlation coeff i cients r=0.999 7. The recovery rates were ranged from 73.0% to 84.8% at the spiked levels of 1.92, 5.12, 12.80 μg／kg, with the relative standard deviations of 4.3%-8.2%（n=6）. The average recovery rates of the 3 concentrations in the two different day were ranged of 77.1%-81.2% and the relative deviations were 1.3%-5.3%. The results indicated that the method was precise, accurate, easy, fast and suitable to complete the determination of clenbuterol residue in pork on daily work.

gas chromatography-mass spectrometry; clenbuterol; pork sample; comparison of method

O658

A

1008-6145（2014）02-0043-04

10.3969／j.issn.1008-6145.2014.02.012

联系人：李莺；E-mail: zixuan100@163.com

2013-12-26