鬼箭羽水溶成分抑制氧化型低密度蛋白诱导的THP-1 源性巨噬细胞炎症因子表达

黄靓 熊文昊 王汉群 邹飞燕 唐志晗 张弛

鬼箭羽水溶成分抑制氧化型低密度蛋白诱导的THP-1 源性巨噬细胞炎症因子表达

黄靓 熊文昊 王汉群 邹飞燕 唐志晗 张弛

目的 探讨鬼箭羽水溶成分对氧化型低密度脂蛋白 (ox-LDL)诱导的 THP-1 源性巨噬细胞炎症因子表达的影响。方法 将 THP-1 源性巨噬细胞分为五个组 , 即对照组、ox-LDL 组、鬼箭羽 1 组、鬼箭羽 2 组、鬼箭羽 3 组。MTT (噻唑蓝 )比色法检测 THP-1 细胞活力 , 酶联免疫吸附法 (ELISA)检测细胞上清液中肿瘤坏死因子 α(TNF-α)、白细胞介素 6(IL-6)的含量。结果 鬼箭羽能明显改善 ox-LDL 作用下 THP-1 源性巨噬细胞的细胞活力 , 抑制 ox-LDL 诱导的细胞炎症因子分泌 , 并且呈现浓度依赖性 , 差异有统计学意义 (P＜0.05)。结论 鬼箭羽水溶成分抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的 THP-1 源性巨噬细胞炎症因子表达有关。

鬼箭羽 ；氧化型低密度脂蛋白 ；THP-1 源性巨噬细胞 ； 细胞活力 ；炎症因子

近年来的研究发现 , 动脉粥样硬化斑块中不仅有脂质沉积 , 还有大量的炎症细胞浸润 , 这说明炎症在动脉粥样硬化的发生、发展过程中起着重要作用。泡沫细胞的形成是动脉硬化早期主要的病理特征 , 氧化型低密度脂蛋白 (oxidized LDL, ox-LDL)对泡沫细胞的形成发挥着举足轻重的作用。血液中的单核细胞在内膜下转化为巨噬细胞 , 继而通过 A 型清道受体不断吞噬大量 ox-LDL, 导致细胞内脂质堆积 ,最终形成泡沫细胞。鬼箭羽是一种主产于我国北部的中药材 , 它是卫矛科植物卫矛的具有翅状物的枝条或翅状附属物 , 其功效在《本经》的载述主要是破血、止痛、通经、泻下、杀虫等；最近的研究表明 , 鬼箭羽具有降低血糖、调节血脂、以及抗动脉粥样硬化等作用。

1 材料与方法

1. 1 药物与试剂 鬼箭羽药材购自衡阳市药材公司 , 经专家鉴定为卫矛科植物的嫩枝和翅状附属物。取鬼箭羽药材500 g加 6倍水 , 2 h/次 , 煎煮 2次 , 浓缩至 3.0 g/ml生药 , 浸膏待用 ；THP-1细胞购自中国科学院上海生物化学与细胞生 物学研究所 细 胞中心 ；RPMI-1640培养基购自 Gibco公司 ；佛波酯购自 sigma公司 ；TNF-α 酶联免疫吸附试剂盒、IL-6酶联免疫吸附试剂盒均购自美国 R&D公司。

1. 2 脂蛋白的分离、氧化修饰及鉴定 健康人血浆购自衡阳市中心血站 , 采用超速离心法制备低密度脂蛋 (LDL), 然后用 含 10 μmol/L CuSO4 的 PBS溶 液 将 LDL氧化修 饰 成 ox-LDL, 4℃ 保存。

1. 3 细胞培养及分组 THP-1细胞用含有 10% 小牛血清RPMI 1640培养液 , 在 37℃、5%CO2培养箱中静置培 养。培养基中加 HEPES 10 mmol/L, 在每次实验前用 160 nmol/L佛波酯处理 24 h, 使其诱导分化成巨噬细胞。实验共分五组 ：①对照组 , 不加 ox-LDL处理 ；② ox-LDL组 50 mg/L ox-LDL处理 24 h组 ；③鬼箭羽 1组 ：3 μg/ml 鬼箭羽和 50 mg/L ox-LDL共处理 24 h组 ；④鬼箭羽 2组 ：10 μg/ml 鬼箭羽和 50 mg/L ox-LDL共处理 24 h组 ；⑤鬼箭羽 3组 ：30 μg/ml 鬼箭羽和50 mg/L ox-LDL共处理 24 h组。

1. 4 统计学方法 采用 SPSS15.0统计软件对该研究的数据进行统计学的分析 , 计量资料以均数 ± 标准差 ( x-±s)表示 ,组间比较采用方差分析和 t检验 , P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2 .1 不同浓度鬼箭羽对 ox-LDL作用下 THP-1巨噬细胞活力的影响 ,见表1。

与对照组比较 , ox-LDL 组细胞活力明显受损 (P＜0.01),不同浓度鬼箭羽组细胞活力较 ox-LDL 组有不同程度的增强 ,且呈现浓度依赖性。

2. 2 鬼箭羽对 ox-LDL 作用下 THP-1 巨噬细胞炎症因子分泌的影响

图 1 鬼箭羽减少 ox-LDL所致的 THP-1细胞 TNF-α 的释放

图 2 鬼箭羽减少 ox-LDL所致的 THP-1细胞 IL-6的释放

THP-1 细胞经 50 mg/L ox-LDL 处理 2 h 后 , 细胞培养上清液中的 TNF-α、IL-6 浓度增加 , 与对照组比较差异有统计 学 意 义 (P＜0.05), 而 ox-LDL+ 不 同 浓 度 (3、10、30 μg/ml)的鬼箭羽处理 2 h 后 , TNF-α、IL-6 浓度显著降低 , 与 ox-LDL 组比较差异均有统计学意义 (P＜0.05), 且呈现出浓度依赖性。

3 讨论

动脉硬化是一种炎症性疾病 , 炎症反应贯穿了动脉硬化发生发展的全过程 , 大量的炎症因子参与到这个过程中 , 对动脉硬化的形成与发展发挥了重要的作用。TNF-α 是一种由单核细胞分泌的炎症与免疫调节因子 , 在 AS 病变中的表达明显增高 , 提示其与 AS 及 CHD 的发生、发展密切相关。IL-6 是一种多功能的前炎症因子 , 能加速肝脏合成 C- 反应蛋白 , 促使血管内皮细胞的活化和血管平滑肌细胞的增生。IL-6 可促进血管内皮细胞粘附分子的表达与释放 , 促使巨噬细胞对 LDL 的摄取 , 促进动脉硬化的形成［1］。

鬼箭羽以卫矛之名始载于《神农本草经》, 现有的研究证明 , 鬼箭羽提取物主要通过降低急性缺血模型大鼠血清 CK、CK-MB、AST、LDH 和 MDA 水 平 , 提 高 大 鼠 血 清SOD、NO 含量来改善心肌细胞耐缺氧的能力 , 从而发挥防治心肌缺血的作用；另外鬼箭羽的提取物能够显著降低糖尿病小鼠的空腹血糖 , 从而改善糖尿病小鼠由于血糖增高所引起的糖代谢紊乱。韩国学者研究报道 , 鬼箭羽通过抑制 IKKβ来减弱 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞 NF-κB 的活化 , 从而抑制 iNOS 的表达和 NO 的产生 , 发挥抗炎的作用。鬼箭羽的提取物还具有清除活性氧自由基的作用 , 可防止生物膜的脂质过氧化。在本研究中 , 首次发现鬼箭羽能够显著降低 50 mg/L ox-LDL 诱发的 THP-1 源性巨噬细胞 TNF-α、IL-6 的释放 ,并提高 ox-LDL 诱导的 THP-1 源性巨噬细胞细胞活力 , 呈现浓度依赖性 , 结果提示鬼箭羽可能通过抑制炎症因子的释放来发挥抗动脉粥样硬化的作用。至于鬼箭羽究竟通过何种信号通路发挥其抗炎作用 , 以及鬼箭羽对于巨噬细胞胆固醇转运的影响 , 作者将在后续的试验中继续研究。

［1］黄德斌 ,余昭芬 .鬼箭羽三种提取物对氧自由基作用的影响 .湖北民族学院学报 , 2006,23(2):4-6.

2014-04-08］

421001 湖南衡阳 , 南华大学心血管病研究所 (黄靓 唐志晗 )；外科学总论教研室 (黄靓 熊文昊 王汉群 邹飞燕 唐志晗 )；机能学实验中心 (张弛 )