胶原神经再生室复合CNTF修复周围神经损伤的作用

王宇博，丁新玲，张春光

（赤峰学院 医学院，内蒙古 赤峰 024000）

胶原神经再生室复合CNTF修复周围神经损伤的作用

王宇博，丁新玲，张春光

（赤峰学院 医学院，内蒙古 赤峰 024000）

目的：讨论应用胶原蛋白制备神经再生室复合CNTF（睫状神经营养因子）修复外周神经缺损的效果.方法：选取30只SD大鼠，随机分为三组，A组胶原神经再生室复合CNTF组、B组单纯胶原神经再生室组、C组原位神经移植组.术后不同时期进行大体观察,并于术后16周进行电生理、组织学、电镜观察及图像分析方法评价神经再生效果.结果：术后16周A和C组的神经传导速度比较差异无统计学意义，均优于B组，且差异有统计学意义（P＜0.05）；再生神经纤维数目、直径及髓鞘厚度的比较，A和C组比较差异无统计学意义，均优于B组，且差异有统计学意义（P＜0.05）.结论：应用胶原神经再生室复合CNTF是一种有效的修复周围神经缺损的方法.

胶原；再生室；CNTF；周围神经损伤

目前认为应用神经再生室修复是周围神经损伤是一种较好方法，而用于制作神经再生室材料的选择中，复合型材料的研究日渐增多.胶原蛋白是细胞外基质的重要组成部分，被证实是制备神经再生室较为合适的天然材料[1]，本实验利用胶原神经再生室复合CNTF桥接损伤神经两断端，并观察其对神经再生的作用.

1 材料与方法

1.1 神经再生室的制备：

利用10gI型胶原蛋白（美国sigma公司）制备成长约12mm长度的胶原神经再生室，将制备好的胶原神经再生室放入-80℃冰箱冷冻过夜,取出后真空冷冻干燥24小时，取出放入2%京平尼溶液中，置于37℃温箱中交联，自然干燥后放置于-4℃环境下保存，以上操作在无菌条件下进行.

1.2 动物分组和模型制备

选取30只SD大鼠，随机分为A、B、C三组，每组10只.使用10%水合氯醛（0.3ml/100g）行腹腔麻醉，无菌条件下暴露坐骨神经，三组均造成约10mm的神经缺损，A组用胶原神经再生室桥接神经缺损两断端各1mm,并向再生室内注入含50μg/ mlCNTF，B组用胶原神经再生室桥接神经缺损两断端各1mm后在再生室内注入生理盐水，C组自体神经原位移植，手术完毕缝合切口.

1.3 实验项目

（1）实验动物观察：术后常规观察实验动物的切口愈合、足部皮肤改变及患肢情况.术后16周,观察神经再生室降解以及坐骨神经再生情况.（2）电生理监测：手术后16周，原位暴露坐骨神经，将记录电极刺入小腿三头肌,刺激电极依次置于再生神经两端,刺激神经，对三组实验动物的神经传导速度进行测定.（3）光镜观察：将再生神经由4%多聚甲醛固定、石蜡包埋后行H-E染色，镜下观察再生神经的结构及形态.（4）电镜观察:从再生神经远段取材,20g/L戊二醛固定,Epon812定向包埋,连续横切片,铀-铅双染,透射电镜观察神经再生情况.（5）采用图像分析系统：计算三组远端再生神经纤维数目、再生神经纤维直径及髓鞘厚度进行比较.

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 大体观察

术后三组大鼠术后切口均愈合良好，患肢拖行，无疼痛反应.术后第2周开始三组大鼠均出现不同程度的足部肿胀，第3周三组陆续出现足部皮肤溃疡，以B组最重，第8周三组大鼠，足部溃疡基本愈合，B组足部溃疡愈合略晚；第16周按原切口，暴露坐骨神经，A、B组再生室降解变薄，A组再生神经较B组略粗，与两端神经连接良好，无明显的结缔组织增生，与周围组织没有明显粘连，C组自体神经移植处两端膨大隆起，可见结缔组织增生.

2.2 神经电生理测定结果

术后16周，各组实验动物的神经传导速度均有所恢复，A与C组神经传导速度比较差异无统计学意义（P＞0.05），均优于B组，且差异有统计学意义（P＜0.05），结果见表1.

表1 术后16周神经传导速度比较（±s）

表1 术后16周神经传导速度比较（±s）

分组 n 运动神经传导速度（m/s）A组B组C组10 10 10 18.57±3.56 15.36±4.09 22.18±3.35

2.3 光镜观察

术后16周行HE染色后光镜下观察可见，三组再生神经均长入远端，A组及B组有髓神经纤维数目多，排列规整而密集，轴突和髓鞘成熟度较好，束间结缔组织较少，均优于C组.

2.4 电镜观察

A组和C组再生神经数目较多，神经纤维直径较为规整，髓鞘厚度较均匀一致，B组再生神经数目较其他两组少，神经纤维直径粗细不等，髓鞘厚度不均匀.

2.5 图像分析

对三组实验动物的远段处进行图像分析显示，单位面积再生神经纤维数、再生神经纤维直径及髓鞘厚度，A和C组比较差异无统计学意义（P＞0.05），均优于B组，且差异有统计学意义（P＜0.05），见表2.

表2 术后16周三组再生神经纤维数目、再生神经纤维直径及髓鞘厚度比较（±s）

表2 术后16周三组再生神经纤维数目、再生神经纤维直径及髓鞘厚度比较（±s）

组别 n 神经纤维数目（根）神经纤维直径（μm）髓鞘厚度（μm）A组B组C组10 10 10 3589.36±319.26 3315.69±353.52 3675.82±506.31 4.05±0.36 3.53±0.23 4.17±0.31 0.45±0.02 0.36±0.05 0.49±0.07

3 讨论

随着显微外科技术的发展，对于周围神经损伤的研究得到了很大的进展.复合神经材料制备再生室桥接神经缺损是目前研究的热点，多种材料复合制备再生室可以整合每种材料的优点，从而对周围神经损伤达到更好的修复效果.

胶原蛋白是细胞外基质的重要组成部分，组织相容性好，无免疫原性，能有效的促进轴突的再生以及雪旺细胞向损伤处迁移，是制备神经再生室较为理想的材料[2-3]，但是胶原蛋白在体内环境下降解速度较快，不利于神经轴突的通过，所以本实验选用京平尼对胶原蛋白进行交联，京平尼是中药中杜仲所含物质，对人体无毒副作用，交联后能降低胶原蛋白的降解速度，有益于神经在再生室内生长[4].CNTF对于神经和肌肉的作用被人们所重视，CNTF可以促进轴突通过再生室，增加轴突数目以及髓鞘的形成[5]，同时有研究表明CNTF能通过促进运动神经轴突的再生，能够使支配区域的肌肉功能有较好的恢复作用[6-7].

应用胶原蛋白制备神经再生室，可以为神经轴突的再生提供良好“微环境”，而神经损伤时远端神经的雪旺细胞内CNTF减少，本实验在胶原神经再生室内添加外源性CNTF，与胶原蛋白共同促进神经轴突再生，增加轴突数目及成熟度，术后16周观察可见胶原神经再生室已经基本降解，再生神经由近端长入远端，在神经电生理检测，形态学观察以及图像分析的结果中显示胶原神经再生室复合CNTF要优于单纯胶原神经再生室，与自体神经移植无明显差异，说明胶原蛋白复合CNTF制备再生室能够较好的桥接外周神经缺损，在今后研究中应该继续的寻求适宜的再生室厚度、弹性及通透性，促使CNTF吸附在再生室壁内，通过再生室逐步降解达到缓释CNTF的效果.

〔1〕XIAO Yu-liang,ZHENG Lian-ying，HAN Jun-fen,eta1.Researchprogressioninco Hagen protein[J].Journal of Taishan Medical CoHege，2005，26(5)：493-497.

〔2〕KitaharaAK,Suzukiy,Peng Q,etal.Facialnerverepairusingcollagennerveconduit incats [J].Scand JPlast Reconstr Surg Hand Surg,1999,33(2):1872193.

〔3〕MatsumotoK，NakamuraT，ShimizuY，eta1.A novelSurgicalmaterialmade from collagen with high mechanicalstrength： A collagen sandwichmembrane明.ASAIOJ，1999，45(4)：288—292.

〔4〕Chen YS，ChangJY，ChengCY，eta1.Anin vivo evaluation ofabiodegradablegenipincross——linkedgelatinperipheralneverguide conduitmaterial[J].Biomaterials，2005，26(3)：391 1—3918.

〔5〕NewmanJP.Ciliaryneurotrophicfactoren.hances peripheralnerveregeneration.Archotolyaryngol Head Neck Surg，1996，122：399.

〔6〕Mc Callister WV.Tang P.Axonal regeneration stimulatedbythecombinationofnervegrowt hfactoran d ciliary neurotrophicfactorin an end-to-sidemode1.JHand Surg[Am]，2001，26：478-488.

〔7〕IpFC，FuAK，Tsim KW.eta1.Differen.tialexpressionofciliaryneurotrophicfactorreceptor inskeletalmuscleofchickandratafternerve injury.JNeuroch～n，1996，67：1607—1612.

R651.3

A

1673-260X（2014）03-0038-02