七鳃鳗含硒谷胱甘肽过氧化物酶2 的分子克隆、 生物学特性及表达分析

赵春晖，徐 玮，王 丹，逄 越，刘 欣，李庆伟

（1. 辽宁师范大学 生命科学学院，辽宁 大连 116081；2. 辽宁师范大学 七鳃鳗研究中心，辽宁 大连 116081）

谷胱甘肽过氧化物酶(Glualhione peroxidase，GPx)是活细胞的抗氧化防御系统中的关键酶之一。抗氧化防御系统保护了细胞免受活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的破坏性影响。ROS 是需氧细胞在代谢过程中产生的一系列活性氧簇，包括超氧阴离子自由基(O2-)，过氧化氢(H2O2)和羟基自由基(OH-)。高浓度活性氧导致氧化应激，能够造成脂质过氧化、蛋白质氧化、DNA 损伤、膜破裂和线粒体功能障碍[1-2]。所有的动物，包括鱼类，都具有保护自身组织免受氧化应激的影响和防止脂质过氧化作用的抗氧化系统。这些系统是由膳食中的抗氧化剂类的维生素和矿物质（如维生素E 和硒），细胞中的抗氧化剂（如谷胱甘肽）和抗氧化酶（如过氧化氢酶和GPxs）构成的[3]。硒依赖的谷胱甘肽过氧化物酶家族中GPx1 和GPx2 酶同源性较高，主要负责调节细胞内的过氧化氢水平和烷基氢过氧化物。它们的区别在于GPx1 几乎在所有类型的细胞中都表达，而GPx2 主要在上皮细胞中表达[4-5]。

七鳃鳗(Lampetra japonica)属无颌脊椎动物，是现存脊椎动物中最古老、最原始的物种之一。其化石记录可以追溯到志留纪及泥盆纪，有现存的“活化石”之称，它印记了从无脊椎动物到脊椎动物的进化历史，同时作为脊椎动物的祖先，又为脊椎动物的起源与进化提供丰富的遗传信息基础。幼体七鳃鳗生活在淡水中，变态后迁移到海洋中以吸食其它鱼类的血肉为生，性成熟后停止进食，洄游到淡水中产卵后死亡。七鳃鳗既是研究脊椎动物进化、胚胎发育、适应性免疫起源理想的模式动物[6-7]，也具有较高食用和药用价值[8]。在本研究中,我们首次克隆得到七鳃鳗GPx2 基因cDNA 全长序列及基因组序列，并进行了序列进化和组织特异性分析， 同时研究了脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激后该基因表达水平的变化，为阐明GPx2 在七鳃鳗免疫防御中的作用和脊椎动物GPx 家族的起源提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料：12 月份由黑龙江省松花江流域同江地区购买成年七鳃鳗(L. japonica)，七鳃鳗体重大约112.0~274.5 g，体长大约36.4～58.4 cm，鱼的活体驯养在实验室水族箱内(2～5℃)。

菌株与质粒：质粒pMD18-T 购自宝生物工程（大连）公司；大肠杆菌DH5α菌株为本实验室保存。

主要试剂：琼脂糖凝胶DNA 纯化试剂盒、质粒小量提取试剂盒、TaKaRa 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0 、 Clontech SMART™ RACE cDNA Amplification Kit、SYBR PrimeScriptTMRT-PCR 试剂盒、TaKaRa MiniBEST Ver.5.0 DNA 试剂盒及DNA Marker 均购于宝生物工程（大连）公司；引物合成及重组质粒目的基因测序由生工生物工程（上海）股份有限公司测定；Trizol 试剂购自GIBCO BRL。

1.2 方法

1.2.1 总RNA 的提取和反转录

健康活跃日本七鳃鳗个体断尾取血，采用ficoll密度梯度离心法进行单个核白细胞分离，取0.2 g 左右白细胞，加入1 mL Trizol 试剂制备匀浆，冰上孵育5 min；加入0.2 mL 氯仿，振荡混匀15 s，直至溶液呈乳白色且无分相现象后于冰上静置5 min，4℃，12 000 ×g，离心10 min。离心后匀浆液分为三层，小心吸取上层溶液600 μL 至新的离心管中，加入等体积预冷异丙醇，振荡充分混匀，冰上孵育30 min；4℃，12 000 ×g，离心10 min，小心弃去上清，保留离心管底的少量白色沉淀；缓缓加入1 mL 预冷的DEPC 配置的75%乙醇，洗涤沉淀，4℃，12000 g，离心5 min，小心吸去上清，保留沉淀；再次洗涤、离心后获得RNA 沉淀；空气中干燥后，用适量TE 或无RNase水溶解备用。使用 Reverse Transcriptase M-MLV (RNase Hˉ)，以总RNA 为模板，以Oligo dT 为反转录引物反转录合成cDNA，反转录反应的条件为：42℃ 60 min，70℃ 15 min，5℃ 5 min。

1.2.2 LjGPx2 cDNA 的全长获得

从本实验室构建的七鳃鳗白细胞cDNA 文库中调取LjGPx2 的EST 片段，将获得的GPx2 序列与其它同源性较高的物种进行序列比对，得到保守的序列，使用primers5.0 软件设计引物见表1。使用上述制备的cDNA 作为模板，基因扩增PCR 反应条件：94℃ 5 min，35 个循环94℃ 1 min，52℃ 30 s，72℃ 1 min，最后72℃下延伸10 min。将所得的PCR 产物用1.0%琼脂糖凝胶检测，并且克隆到pMD18-T 载体进行DNA 测序。3'-RACE 扩增条件为：94℃ 3 min，30个循环94℃ 30 s，54.5℃ 30 s，72℃ 1 min，最后循环是72℃ 10 min，5'-RACE 扩增条件为：94℃ 3 min，30 个循环94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 90 s，最后循环是72℃ 10 min，将PCR 产物克隆到pMD18-T 上，并导入大肠埃希菌DH5α感受态菌中，提取重组质粒进行DNA 测序。3'和5'片段的拼接用的是DNA man (Lynnon Biosoft)软件并获得LjGPx2 cDNA 全长。

表1 PCR 引物的序列

1.2.3 基因组DNA 序列及结构分析

提取七鳃鳗白细胞基因组DNA 并保存在-20℃备用。设计引物见表1，PCR 扩增的条件是：94℃ 3 min，35 个循环94℃ 1min，55℃ 30 s，72℃ 90s，最后的循环是72℃ 10 min。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分析，并进行DNA 测序。GPx2 外显子-内含子结构分析使用的是NCBI 核苷酸数据库，查找其它物种GPx2 核苷酸序列，将GPx2 核苷酸序列输入Ensemble 数据库进行BLAST 比对，用比对的结果分析外显子-内含子数目并进行统计。

1.2.4 氨基酸序列及系统进化分析

开放阅读框(ORF)分析使用NCBI 在线预测软件。信号肽预测使用SignalP 4.1。使用ClustalX 2.0 软件进行多重序列比对，构建系统发育树的用Neighbor-joining(NJ)法和MEGA6.0 软件。

1.2.5 Real Time PCR 法检测目的基因的相对表达量

七鳃鳗分为两组，一组为对照组，另一个是LPS刺激组。刺激组用200 μL(50μg/mL) LPS 进行腹腔注射，对照组腹腔注射200 μL 0.9%氯化钠，加强免疫三周后提取组织和白细胞mRNA 冻存于-80℃保存备用[9]。使用Trizol 试剂提取口腔腺、心脏、肌肉、肝脏、肾脏、鳃、肠、骨髓、生殖腺、卵和白细胞中总RMA。实时定量PCR 反应体系包含12.5 μL Master SYBR Green (TaKaRa) mix，1 μL 引物(10 μM)，2 μL cDNA (100 ng/μL)和水，总体系25 μL。PCR 反应条件为: 95℃ 30 s，40 个扩增循环 95℃ 5 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s。以七鳃鳗GAPDH 基因作为内参，上述所有反应均重复三次。TaKaRa TP800 PCR 检测系统分析得到特异性的溶解曲线和扩增曲线。使用2-ΔΔCt方法对LjGPx2 mRNA 转录水平进行计算分析[10]。

2 结果

2.1 七鳃鳗LjGpx2 基因克隆及序列分析

图1 显示LjGPx2 全长868 bp，其中包括564 bp ORF 区，53bp 5′UTR 区和251bp 3′UTR 区。LjGPx2 ORF 区564bp，编码187 个氨基酸，蛋白质分子质量预测为20.57 kDa。由终止密码子编码的酶活性位点为硒代半胱氨酸(36 TGA)。LjGPx2 具有含硒GPxs均含有的LGFPCNQF 序列和WNFEKF 活性部位[11]。谷氨酰胺(Q67，Q71)和色氨酸(W139，W149)参与硒的固定。四个精氨酸残基(R41，R87，R144，R165)为谷胱甘肽底物催化中心。SECI Search 2.19 程序鉴定了3′UTR 区含有1 个硒代半胱氨酸插入序列(selenocysteine insertion sequence, SECIS)(如图1)。3′UTR 区含有AATAAA 多聚腺苷酸信号。LjGPx2 没有检测到信号肽和跨膜结构。LjGPx2 序列已被提交到NCBI 数据库(序列号KM211710)。

图1 LjGPx2 核酸和氨基酸序列

黑框内ATG 是起始密码子，TAG 是终止密码子；灰色阴影为硒代半胱氨酸TGA(sec)，精氨酸残基(R41，R87，R144，R165)，谷氨酰胺(Q67，Q71)和色氨酸(W139，W149)；下划线为LGFPCNQF 序列和WNFEKF 活性部位，3'UTR 区SECIS 元素插入位点，3’ UTR 区AATAAA 多聚腺苷酸信号。

多序列比对结果表明，七鳃鳗GPx2 氨基酸序列与其它无脊椎动物和脊椎动物GPx2 有很高的保守性，含有同源序列和硒代半胱氨酸位点U(如图2)。使用Mega6.0软件中neighbor-joining建树方法构建系统发育树。所得到的系统发育树主要包括两大类群(如图3):(1)哺乳动物和鸟类 (2)爬行动物，两栖动物和鱼类。在系统发育树中LjGPx2 位于“爬行动物，两栖动物和鱼类”分支。

2.2 LjGPx2 基因组结构分析

图2 LjGPx2 氨基酸同源序列比对

图3 基于邻接法构建的氨基酸序列的系统发育树

测序得到LjGPx2 基因组序列共3471bp，并提交到NCBI 数据库(序列号KM211711)。LjGPx2 包含两个外显子(54-266 bp，2870-3220 bp)和1 个内含子区域，所有外显子-内含子边界均有拼接受体(AG)和(GT)位点。图4 是与其它同源GPx2 基因组结构比较，哺乳动物、鱼类和两栖类的基因组结构包含2 个外显子编码区和1 个内含子区。sinensis)GPx2，XP_006111005.1；褐家鼠(Rattus norvegicus)GPx2，NP_899653.2；牛(Bos taurus)GPx2，NP_001156611.1；白掌长臂猿(Hylobates lar)GPx2，BAE17011.1；家兔(Oryctolagus cuniculus)GPx2，NP_001243822.1；马(Equus caballus)GPx2，NP_001159953.1；猎隼(Falco cherrug)GPx2，XP_005438368.1；白喉带鹀(Zonotrichia albicollis)GPx2，XP_005496960.1；鲫鱼(Carassius auratus)GPx1，AGC50802.1；豚鼠(Cavia porcellus)GPx1，XP_003476496.1；白犀(Ceratotherium simum)GPx1，XP_004444023.1；中国仓鼠(Cricetulus griseus)GPx1，NP_001243717.1；狼(Canis lupus)GPx1，NP_001108591.1；斑马鱼(Danio rerio)GPx1，NP_001007282.2；斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)GPx1，NP_001187670.2；矛尾鱼(Latimeria chalumnae)GPx1，XP_005992733.1；小家鼠(Mus musculus)GPx1，NP_032186.2；虹鳟(Oncorhynchus mykiss)GPx1，NP_001117997.2；斑胸草雀(Taeniopygia guttata)GPx1，NP_001130041.1；热带爪蟾(Xenopus (Silurana) tropicalis)GPx1，NP_001015740.2；安乐蜥(Anolis carolinensis)GPx1，XP_008103229.

图4 GPx2 基因组结构比较

2.3 实时荧光定量PCR 分析LjGPx2 基因在组织中表达情况

实时荧光定量PCR 分析日本七鳃鳗各个组织中LjGPx2 的转录水平。检测的数据表明LjGPx2 在七鳃鳗的肝脏、鳃、肾、肠、心脏、肌肉、口腔腺、髓、生殖腺、卵和白细胞中均有表达，但是在口腔腺中表达最高(GAPDH mRNA 表达水平的58.4 倍)，在卵(58.2 倍)、心脏(55.0 倍)、生殖腺(51.7 倍)表达较高。在肝脏(5.9 倍)和肾脏(9.3 倍)中表达量低。通过LPS刺激后，与其它组织相比较，LjGPx2 在生殖腺中的表达量明显的升高(刺激后较对照组升高3 倍；P< 0.05)，在肠中升高2.3 倍(刺激后较对照组)，在卵中升高1.4 倍(刺激后较对照组)(图5)。

3 讨论

七鳃鳗以其独特的进化地位和独有的免疫系统成为研究脊椎动物免疫系统和抗氧化系统起源和进化的重要物种。本研究首次克隆了GPx2 cDNA 全长序列。GPx2 全长868 bp，其中ORF 区为564 bp，编码由187 个氨基酸组成的多肽。GPx2 基因保留了较多高度保守的残基(R41，Q67，Q71，W140，W149，R87，R144，R165，和U36)和氨基酸序列(LGFPCNQF，WHFEKFL)。硒代半胱氨酸(Sec)是由终止密码子(TGA)编码，位于该基因的第36 个氨基酸。这种编码机制依赖于特殊的Sec t-RNA、延长因子及通过形成茎环结构来帮助Sec tRNA 识别TGA 密码子的位于mRNA 3′-UTR 中的SECIS[12]。

图5 LjGPx2 mRNA 在免疫前后七鳃鳗各组织中相对表达量分析

氨基酸序列比对和系统发育树分析表明，七鳃鳗的GPx2 同其它物种的GPx1 和GPx2 具有较高的同源性，与GPx2 家族的相似性更近；同时该结果也说明七鳃鳗可能单独成为一个进化分支，位于高等脊椎动物GPx2 基因的外群，这也与目前研究的七鳃鳗的进化地位是相一致的。

GPx2 是细胞内抗氧化防御系统的一个重要的组成部分，我们分析了GPx2 基因在七鳃鳗各组织中分布情况，结果表明，GPx2 在多种组织中均有表达，提示其作为一种重要的抗氧化酶，在维护组织正常功能方面可能发挥着非常重要的作用。其中在口腔腺中高表达，可能与它的生活习性相关；成年的七鳃鳗以吸食鱼体为食，口腔腺作为第一道免疫防御系统具有重要作用。其次，在卵和生殖腺中有较高的表达，提示GPx2 可能在保护卵和生殖腺免受氧化损伤方面发挥重要作用。肠道黏膜组织是先天性免疫系统重要组成部分，担负着重要的免疫功能，GPx2 在肠中表达量也较高，表明GPx2 与肠道免疫过程相关。在哺乳动物中，GPx2 是胃肠道专属性类型[12]。脂多糖LPS刺激后LjGPx2 在生殖腺中的表达水平与对照组相比升高3 倍，在卵中的表达水平升高1.4 倍。表明GPx2可能参与七鳃鳗生殖免疫应答反应，但相关的反应机制还需要后续实验的进一步研究。

[1] Schreck R, Rieber P, Baeuerle P A. Reactive oxygen intermediates as apparently widely used messengers in the activation of activation of the NF-kappa B transcription factor and HIV-1[J]. EMBO, 1991, 10: 2247-2258.

[2] Mourente G, Tocher D R, Diaz E, et al. Relationships between antioxidants, antioxidan enzyme activities and lipid peroxide- tion products during early development in Dentex dentex eggs and larvae [J]. Aquaculture, 1999, 179:3 09-324.

[3] Winston G W, Di Giulio R T. Prooxidant and antioxidant mechanisms in aquatic organisms [J]. Aquat Toxicol, 1991, 19: 137-161.

[4] Peskin A V, Low F M, Paton L N, et al. The high reactivity of peroxiredoxin 2 with H(2)O(2) is not reflected in its reaction with other oxidants and thiol reagents [J]. Biol Chem, 2007, 282: 11885-11892.

[5] Brigelius F R, Muller C, Menard J, et al. Functions of GI-GPx: lessons from seleniumdependent expression and intracellular localization [J]. Biofactors, 2001, 14: 101-106.

[6] Sower S A, Moriyama S, Kasahara M, et al. Identification of sea lamprey GTH[beta]-like cDNA and its evolutionary implications [J]. Gen Comp Endocr, 2006, 148: 22-32.

[7] Amemiya C T, Saha N R, Zapata A. Evolution and development of immunological structures in the lamprey [J]. Curr Opin Immunol, 2007, 19: 535-541.

[8] 谢鹏, 赵春晖, 李庆伟. 动物唾液腺功能组分研究进展[J]. 动物医学进展, 2011, 32(6): 134-138.

[9] Sun J, Liu X, Li Q. Molecular cloning, expression and antioxidant activity of a peroxiredoxin 2 homologue from Lampetra japonica [J]. Fish Shellfish Immun, 2010, 28: 795-801.

[10] Arocho A, Chen B, Ladanyi M, et al. Validation of the 2- DeltaDeltaCt calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts [J]. Diagn Mol Pathol, 2006, 15: 56-61.

[11] Mahanama D Z, Wickramaarachchilage A P, Chulhong O, et al. Transcriptional up-regulation of disk abalone selenium dependent glutathione peroxidase by H2O2oxidative stress and Vibrio alginolyticus bacterial infection[J]. Fish Shellfish Immun, 2008, 25: 446-457.

[12] Janene L T, Valene H L S, Philip M T, et al. Cloning and characterization of two glutathione peroxidase cDNAs from southern bluefin tuna(Thunnus maccoyii)[J]. Comp Biochem Phys B, 2010, 156: 287-297.