石墨烯-壳聚糖修饰玻碳电极检测牛奶中的三聚氰胺

杨晓蕊，徐 婧，马丽娜，郭 明

（大连大学 环境与化学工程学院，辽宁 大连 116622）

自2007 年玫瑰宠物食品中毒事件[1]和2008 年三鹿婴幼儿奶粉事件[2]等食品安全问题后，三聚氰胺（Melamine, C3H6N6）的危害引起人们的广泛关注。人体摄入三聚氰胺将导致生殖、泌尿系统疾病，如肾结石、膀胱癌等[2]。目前，检测三聚氰胺的方法主要有：电位滴定法[3]，毛细管电泳[4-5]，高效液相色谱法[6]，高效液相色谱-质谱/质谱法[7]，气相色谱-质谱联用法[8]，高效液相色谱-紫外法[9]，高效液相色谱-二极管阵列法[10]及其他电化学检测方法[11-15]等。但这些方法仪器设备较复杂，移动不方便，现场应用较难。电化学工作站作为一种操作简便、分析成本低的仪器[16]，对三聚氰胺的检测具有良好的应用前景。目前，以电化学法检测三聚氰胺的应用已有报道。张义根等[17]使用溶胶-凝胶分子印迹技术，以电化学分析法检测了三聚氰胺，线性范围为1.0×10-7~1.0×10-3mol/L。金根娣等[18]用裸玻碳工作电极，以电化学法建立测定牛奶中三聚氰胺的方法，线性范围和检出限分别为15~345 mg/kg 和5 mg/kg。

石墨烯(Graphene, GR)作为目前发现的最薄的二维材料，碳原子紧密堆积形成单层二维蜂窝状晶格结构，具有良好的导电性[19-20]。石墨烯制备简单、成本低、具有独特的超导性能以及新型的量子霍尔效应[21-23]等优点，已应用于双酚A[24-26]、抗坏血酸[27]、苏丹红[28]、咖啡因[29]、克伦特罗[30-31]等样品的检测。本文将石墨烯分散于壳聚糖（Chitosan, CTS）中修饰于玻碳电极（Glassy Carbon Electrode, GCE）表面，以石墨烯-壳聚糖修饰电极（CTS/GR/GCE），分析研究了三聚氰胺在CTS/GR/GCE 上的电化学行为，对于实际样品的定性和定量检测效果明显，可用于实际样品检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI600C 电化学工作站(上海辰华仪器公司）、CS300 电化学工作站(武汉科斯特仪器公司）、（三电极系统：玻碳电极GC 为工作电极，Ag/AgCl 为参比电极，铂电极为对电极）、KQ-100DB 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、Mettler Toledo PL 203 电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）、扫描电子显微镜（HITACHI S-4800）

三聚氰胺、壳聚糖（配制成0.3 g/L 壳聚糖乙酸溶液）等试剂均为分析纯。

1.2 石墨烯壳聚糖电极的制备

1.2.1 玻碳电极（GC）预处理

先将玻碳电极在金相砂纸上打磨，接着分别以粒径为1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm 的Al2O3抛光粉在湿润的麂皮上抛光打磨成镜面，然后依次用去离子水、HNO3（浓HNO3:水＝1:1，V/V）、无水乙醇、去离子水在超声波清洗器中清洗10 min。为增加电极表面电活性点的浓度，将电极在0.5 mol /L H2SO4中活化，直到得到稳定的伏安曲线。

1.2.2 石墨烯-壳聚糖修饰电极（CTS/GR/GCE 电极）的制备

采用Hummers 法[25]将石墨粉制备得到氧化石墨烯，对制得的氧化石墨烯进行还原，得到石墨烯粉末。图1 为扫描电子显微镜（SEM）对合成的石墨烯进行的分析测试。由图可见，合成的石墨烯为片层结构，边缘少量褶皱为石墨烯聚集的结果。

图1 石墨烯的扫描电子显微镜

配制25 mL 石墨烯-壳聚糖修饰液：取1.5 g/L 石墨烯溶液与0.3 g/L 壳聚糖乙酸以体积比为1:2 混合，超声使其分散均匀，即可得到石墨烯浓度为0.5 g/L石墨烯-壳聚糖修饰液。

移取5μL 0.5 g/L 石墨烯-壳聚糖修饰液于GCE表面，红外灯下烘干30 min 得到灰黑色修饰膜，冷却后即得石墨烯-壳聚糖修饰电极（CTS/GR/GCE 电极）。

1.3 牛奶中三聚氰胺的测定方法

移取5 mL 牛奶加水稀释至25 mL，加三聚氰胺标准溶液，搅拌均匀。再以2 mol /L H2SO4为溶剂稀释到50 mL，搅拌均匀，静置5 min。由于牛奶中的蛋白质遇稀硫酸变质凝固为白色絮状沉淀，固本实验采用常规过滤方法，用化学分析滤纸与漏斗过滤，所得到的滤出液以修饰好的CTS/GR/GCE 电极进行循环伏安法研究。

2 结果与讨论

2.1 石墨烯分散剂的选择

本实验选择了几种石墨烯的分散剂，如水、石蜡、聚乙二醇等，最后发现壳聚糖效果较好，图2 为采用差分脉冲法（DPV）以H2O、壳聚糖为石墨烯的分散剂对比裸玻碳电极（GCE），以1 mol /L H2SO4为溶剂，检测1×10-4mol /L 三聚氰胺溶液的实验结果。实验中采用的电压范围为0～1.5 V，振幅为0.05，电位增量为0.004 V，脉冲宽度为0.05 s，脉冲周期为0.2 s，采样间隔为0.001 s。 由图2 可知：与GCE 相比，在0.5 V 附近，三聚氰胺在以壳聚糖为石墨烯分散剂修饰电极（CTS/GR/GCE 电极）上的电流相应信号最大，特征峰值最大，说明CTS/GR/GCE 电极对三聚氰胺具有较好的电催化效应。这是由于石墨烯具有的独特纳米网状结构加大了玻碳电极的比表面积，使得三聚氰胺在CTS/GR/GCE 电极上的电流相应信号增大，反应活性明显增强[32]。故本实验选取壳聚糖为石墨烯的分散剂。

图2 石墨烯分散剂的差分脉冲（DPV）对比图

2.2 三聚氰胺在石墨烯壳聚糖电极上的电化学行为

本实验以修饰好的CTS/GR/GCE 电极为工作电极，Ag/AgCl 参比电极、铂电极对电极进行循环伏安法研究。经过多次实验，选取了三聚氰胺的最佳测定条件：以1 mol/L H2SO4为溶剂，扫描电压范围为0～1.9 V，扫描速度为100 mV/s，检测1×10-3mol/L 三聚氰胺溶液。实验结果见图3，结果表明：在0.8 V和0.765 V 处出现一对明显的氧化还原峰。由于这对特征峰的峰电流值与三聚氰胺的浓度呈正比关系，故可以对三聚氰胺待测液进行定性定量检测。

图3 三聚氰胺在CTS/GR/GCE 电极上的循环伏安图

2.3 溶剂的选择

实验中分别选取了H2O、pH=4.0 的HAc-NaAc、pH=7.5 的PBS、10%三氯乙酸、1 mol /L 的H2SO4等为三聚氰胺的溶剂，在电压范围为0～1.9 V，扫描速度为100 mV/s 时，采用循环伏安法扫描含三聚氰胺溶液。实验结果表明，以1 mol /L H2SO4为三聚氰胺的溶剂时，三聚氰胺在0.8 V 附近出现一对明显的氧化还原峰，而选用其他溶剂时，峰型及峰电流较差。说明酸度为该氧化还原过程关键，故本实验选取1 mol /L H2SO4为测定三聚氰胺的溶剂。

2.4 扫描速率与扫描时间

为获得最佳的测定结果，采用修饰好的CTS/GR/GCE 电极分别在1 mol /L H2SO4为溶剂、对1×10-3mol /L 三聚氰胺溶液进行测定，重点考察了扫描速率和扫描时间两个参数。实验结果表明，扫描速率在50～500 mV/s 时，三聚氰胺在CTS/GR/GCE 电极上反应受吸附控制。当v＞100 mV/s，吸附时间随扫描速率的增大而减小，峰形逐渐变差，且扫描速率较大时灵敏度会降低，故为减少实验时间增加实验灵敏度，本实验选择100 mV/s 作为扫描速度。

本实验还考察了不同扫描圈数对三聚氰胺峰电流的影响。实验结果表明：平均100 圈后，三聚氰胺开始在CTS/GR/GCE 电极上吸附，出现氧化还原峰。但随着扫描圈数的增加，峰电流值的增加缓慢，为节省实验时间，本实验中扫描圈数最多为150 圈。

2.5 线性范围及检出限

如图4 所示，以循环伏安法在最佳测定条件下测定时，不同浓度的三聚氰胺与一对氧化还原峰之间符合线性关系。经测定：三聚氰胺的线性检测范围为5×10-3～5×10-5mol/L，氧化峰与三聚氰胺浓度的线性回归方程为I=0.0035 C+9×10-6，相关系数R= 0.9917；还原峰与三聚氰胺浓度的线性回归方程为I=-0.0005 C-5×10-6，相关系数R=0.9938。在该检测条件下，检出限为1×10-5mol/L。

图4 不同浓度三聚氰胺在CTS/GR/GCE 电极上的循环伏安图

曲线1~8 分别为三聚氰胺浓度5×10-3、2×10-3、1×10-3、6×10-4、2×10-4、1×10-4、8×10-5、5×10-5mol/ L；右下角图为氧化峰、还原峰与三聚氰胺浓度的标准曲线图。

2.6 重现性与稳定性

在最佳测定条件下，以同一根修饰好的CTS/GR/GCE 电极分别测定1×10-3mol/L 三聚氰胺样品溶液，重复测定6 次，峰电流分别为1.29×10-5A，

1.30×10-5A，1.29×10-5A，1.26×10-5A，1.28×10-5A，1.31×10-5A，平均峰电流为1.288×10-5A，相对标准偏差RSD 为1.23 %，表明该电极具有良好的重现性。

2.7 电极稳定性实验

将该电极室温放置48 h 后重复上述实验，结果表明，峰电流略有下降，峰电流为1.16×10-5A，约为上述实验测定值的90.1 %，表明该电极具有良好的稳定性。

2.8 干扰实验

在最佳测定条件下，在1×10-3mol /L 三聚氰胺溶液中，分别加入常见无机盐和有机化合物，研究其对三聚氰胺的干扰情况。实验结果表明：500 倍的常见无机盐NaCl、KNO3，100 倍的葡萄糖、牛血清白蛋白（BSA）和尿素等均不干扰三聚氰胺的检测。由此可见，该方法具有良好的选择性，可以有效地应用于实际样品的检测。

2.9 样品的测定

选取市场上销售的某两种知名品牌的牛奶，以实验方法1.3 进行研究，实验结果见表1。实验结果表明，该方法对实际样品的检测效果明显，加标回收率为93%～101%。

表1 样品中三聚氰胺含量的测定（n=3）

3 结语

利用石墨烯-壳聚糖修饰电极（CTS/GR/GCE 电极）构建了一种检测牛奶中三聚氰胺的新方法。三聚氰胺的线性检测范围为5×10-3～5×10-5mol/L，检出限为1×10-5mol/L，相对标准偏差RSD 为1.23%。该方法准确、灵敏度高、重现性好，在实际样品的检测中具有良好的应用前景。

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