体内D酸性氨基酸分析的自动二维手性高效液相色谱法的建立及应用

韩海等

摘 要 D酸性氨基酸的生理功能和疾病标志物作用已逐渐成为代谢组学和创新药物开发的研究热点，本研究利用硅胶基质ODS整体柱为第一维分离色谱柱，乙腈三氟醋酸

1 引 言

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

References

1 Fujii N. Orig. Life Evol. Biosph.， 2002， 32（2）： 103-127

2 Aniello A D. Brain Res. Rev.， 2007， 53（2）： 215-234

3 Dudel J. Eur. J. Neurosci.， 2004， 20（1）： 161-166

4 Ptzold R， Schieber A， Brückner H. Biomed. Chromatogr.， 2005， 19（6）： 466-473

5 Han H， Miyoshi Y， Ueno K， Okamura C， Tojo Y， Mita M， Lindner W， Zaitsu K， Hamase K. J. Chromatogr. B， 2011， 879（29）： 3196-3202

6 LU Xin， LU Jie， LIU ChengWei， ZHAO ShuLin. Chinese J. Anal Chem.， 2007， 35（8）： 1151-1154.

卢 昕， 卢 洁， 刘承伟， 赵书林. 分析化学， 2007， 35（8）： 1151-1154

7 Tsesarskaia M， Galindo E； Szokan G. Biomed. Chromatogr.， 2009， 23（6） ：581-587

8 Morikawa A， Hamase K， Inoue T， Konno R， Niwa A， Zaitsu K. J. Chromatogr. B， 2001， 757（1）： 119-125

9 SHEN HanXi， YANG GuoSheng， GAO RuYu，WANG QinSun. Chem. J. Chinese Universities， 1995， 16（7）： 1072-1074

沈含熙， 杨国生， 高如瑜， 王琴孙. 高等学校化学学报， 1995， 29（7）： 1072-1074

10 Song Y， Feng Y， LeBlanc MH， Zhao SL， Liu YM. Anal. Chem.， 2006， 78（23）： 8121-8128

11 Huang Y， Shi M， Zhao SL. J. Sep. Sci.， 2009， 32（17）： 3001-3006

12 Thorsen G， Bergquist J. J. Chromatogr. B， 2000， 745（2） ： 389-397

13 Fujii N， Kaji Y， Fujii N. J Chromatogr B， 2011， 879（29）： 3141-3147

14 Toichi E， Hanada K， Hosokawa T， Higuchi K， Hosokawa M， Imamura S， Hosono M. Mech. Ageing. Dev.， 1997， 99（3）： 199-217

Establishment and Application of an Automated Chiral Two

dimensional High Performance Liquid Chromatography

for Bioanalysis of DAcidic Amino Acids

HAN Hai*， WANG QiQin， WU HuiHui， WANG Huan

（College of Pharmacy， Jinan University， Guangzhou 510632， China）

Abstract The physiological and biomarker function of Dacidic amino acids is now becoming the hot topic on metabolomics study and new drug discovery. A fully automated twodimensional high performance liquid chromatography （2DHPLC） system was established by using monolithic ODS column as the first dimension column， acetonitriletrifluoro acetic acidwater （9∶0.05∶92， V/V） as the mobile phase； micro Chiralpak QD1AX column as the enantiomer separation column， 10 mmol/L citric acid in methanolacetonitrile （50∶50， V/V） as the mobile phase for the second dimension， 4fluoro7nitro2，1，3benzoxadiazole （NBDF） as the fluorometrical derivative reagent. The separation efficiency （Rs>2.5）， determination sensitivity （LOD=1 fmol） of acidic amino acids enantiomers were higher than those of existing methods， and an online confirmation of the enantiomers amounts was also achieved using this system. The recoveries were around 97104%， RSD values for intraday and interday precision were less than 5% for the acidic amino acids enantiomers in the biological samples. Furthermore， by analyzing the aging model senescence accelerated mouse prone 1 （SAMP1） mice which have low immunocompetence， the amounts of Daspartic acid in thymus and spleen were determined as （206±18） and （264±21） nmol/g， respectively. It is the first time that an obvious trend of the increasement of Daspartic acid （p<0.01） was observed in thymus and spleen of SAMP1 mice compare to senescence accelerated mouse resistant 1 （SAMR1） mice.

Keywords DAcidic amino acids； Enantiomers； Fullautomated； Twodimensional high performance liquid chromatography； Senescence accelerated mouse prone 1

（Received 3 January 2014； accepted 6 March 2014）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 81202499）

摘 要 D酸性氨基酸的生理功能和疾病标志物作用已逐渐成为代谢组学和创新药物开发的研究热点，本研究利用硅胶基质ODS整体柱为第一维分离色谱柱，乙腈三氟醋酸

1 引 言

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

References

1 Fujii N. Orig. Life Evol. Biosph.， 2002， 32（2）： 103-127

2 Aniello A D. Brain Res. Rev.， 2007， 53（2）： 215-234

3 Dudel J. Eur. J. Neurosci.， 2004， 20（1）： 161-166

4 Ptzold R， Schieber A， Brückner H. Biomed. Chromatogr.， 2005， 19（6）： 466-473

5 Han H， Miyoshi Y， Ueno K， Okamura C， Tojo Y， Mita M， Lindner W， Zaitsu K， Hamase K. J. Chromatogr. B， 2011， 879（29）： 3196-3202

6 LU Xin， LU Jie， LIU ChengWei， ZHAO ShuLin. Chinese J. Anal Chem.， 2007， 35（8）： 1151-1154.

卢 昕， 卢 洁， 刘承伟， 赵书林. 分析化学， 2007， 35（8）： 1151-1154

7 Tsesarskaia M， Galindo E； Szokan G. Biomed. Chromatogr.， 2009， 23（6） ：581-587

8 Morikawa A， Hamase K， Inoue T， Konno R， Niwa A， Zaitsu K. J. Chromatogr. B， 2001， 757（1）： 119-125

9 SHEN HanXi， YANG GuoSheng， GAO RuYu，WANG QinSun. Chem. J. Chinese Universities， 1995， 16（7）： 1072-1074

沈含熙， 杨国生， 高如瑜， 王琴孙. 高等学校化学学报， 1995， 29（7）： 1072-1074

10 Song Y， Feng Y， LeBlanc MH， Zhao SL， Liu YM. Anal. Chem.， 2006， 78（23）： 8121-8128

11 Huang Y， Shi M， Zhao SL. J. Sep. Sci.， 2009， 32（17）： 3001-3006

12 Thorsen G， Bergquist J. J. Chromatogr. B， 2000， 745（2） ： 389-397

13 Fujii N， Kaji Y， Fujii N. J Chromatogr B， 2011， 879（29）： 3141-3147

14 Toichi E， Hanada K， Hosokawa T， Higuchi K， Hosokawa M， Imamura S， Hosono M. Mech. Ageing. Dev.， 1997， 99（3）： 199-217

Establishment and Application of an Automated Chiral Two

dimensional High Performance Liquid Chromatography

for Bioanalysis of DAcidic Amino Acids

HAN Hai*， WANG QiQin， WU HuiHui， WANG Huan

（College of Pharmacy， Jinan University， Guangzhou 510632， China）

Abstract The physiological and biomarker function of Dacidic amino acids is now becoming the hot topic on metabolomics study and new drug discovery. A fully automated twodimensional high performance liquid chromatography （2DHPLC） system was established by using monolithic ODS column as the first dimension column， acetonitriletrifluoro acetic acidwater （9∶0.05∶92， V/V） as the mobile phase； micro Chiralpak QD1AX column as the enantiomer separation column， 10 mmol/L citric acid in methanolacetonitrile （50∶50， V/V） as the mobile phase for the second dimension， 4fluoro7nitro2，1，3benzoxadiazole （NBDF） as the fluorometrical derivative reagent. The separation efficiency （Rs>2.5）， determination sensitivity （LOD=1 fmol） of acidic amino acids enantiomers were higher than those of existing methods， and an online confirmation of the enantiomers amounts was also achieved using this system. The recoveries were around 97104%， RSD values for intraday and interday precision were less than 5% for the acidic amino acids enantiomers in the biological samples. Furthermore， by analyzing the aging model senescence accelerated mouse prone 1 （SAMP1） mice which have low immunocompetence， the amounts of Daspartic acid in thymus and spleen were determined as （206±18） and （264±21） nmol/g， respectively. It is the first time that an obvious trend of the increasement of Daspartic acid （p<0.01） was observed in thymus and spleen of SAMP1 mice compare to senescence accelerated mouse resistant 1 （SAMR1） mice.

Keywords DAcidic amino acids； Enantiomers； Fullautomated； Twodimensional high performance liquid chromatography； Senescence accelerated mouse prone 1

（Received 3 January 2014； accepted 6 March 2014）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 81202499）

摘 要 D酸性氨基酸的生理功能和疾病标志物作用已逐渐成为代谢组学和创新药物开发的研究热点，本研究利用硅胶基质ODS整体柱为第一维分离色谱柱，乙腈三氟醋酸

1 引 言

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

References

1 Fujii N. Orig. Life Evol. Biosph.， 2002， 32（2）： 103-127

2 Aniello A D. Brain Res. Rev.， 2007， 53（2）： 215-234

3 Dudel J. Eur. J. Neurosci.， 2004， 20（1）： 161-166

4 Ptzold R， Schieber A， Brückner H. Biomed. Chromatogr.， 2005， 19（6）： 466-473

5 Han H， Miyoshi Y， Ueno K， Okamura C， Tojo Y， Mita M， Lindner W， Zaitsu K， Hamase K. J. Chromatogr. B， 2011， 879（29）： 3196-3202

6 LU Xin， LU Jie， LIU ChengWei， ZHAO ShuLin. Chinese J. Anal Chem.， 2007， 35（8）： 1151-1154.

卢 昕， 卢 洁， 刘承伟， 赵书林. 分析化学， 2007， 35（8）： 1151-1154

7 Tsesarskaia M， Galindo E； Szokan G. Biomed. Chromatogr.， 2009， 23（6） ：581-587

8 Morikawa A， Hamase K， Inoue T， Konno R， Niwa A， Zaitsu K. J. Chromatogr. B， 2001， 757（1）： 119-125

9 SHEN HanXi， YANG GuoSheng， GAO RuYu，WANG QinSun. Chem. J. Chinese Universities， 1995， 16（7）： 1072-1074

沈含熙， 杨国生， 高如瑜， 王琴孙. 高等学校化学学报， 1995， 29（7）： 1072-1074

10 Song Y， Feng Y， LeBlanc MH， Zhao SL， Liu YM. Anal. Chem.， 2006， 78（23）： 8121-8128

11 Huang Y， Shi M， Zhao SL. J. Sep. Sci.， 2009， 32（17）： 3001-3006

12 Thorsen G， Bergquist J. J. Chromatogr. B， 2000， 745（2） ： 389-397

13 Fujii N， Kaji Y， Fujii N. J Chromatogr B， 2011， 879（29）： 3141-3147

14 Toichi E， Hanada K， Hosokawa T， Higuchi K， Hosokawa M， Imamura S， Hosono M. Mech. Ageing. Dev.， 1997， 99（3）： 199-217

Establishment and Application of an Automated Chiral Two

dimensional High Performance Liquid Chromatography

for Bioanalysis of DAcidic Amino Acids

HAN Hai*， WANG QiQin， WU HuiHui， WANG Huan

（College of Pharmacy， Jinan University， Guangzhou 510632， China）

Abstract The physiological and biomarker function of Dacidic amino acids is now becoming the hot topic on metabolomics study and new drug discovery. A fully automated twodimensional high performance liquid chromatography （2DHPLC） system was established by using monolithic ODS column as the first dimension column， acetonitriletrifluoro acetic acidwater （9∶0.05∶92， V/V） as the mobile phase； micro Chiralpak QD1AX column as the enantiomer separation column， 10 mmol/L citric acid in methanolacetonitrile （50∶50， V/V） as the mobile phase for the second dimension， 4fluoro7nitro2，1，3benzoxadiazole （NBDF） as the fluorometrical derivative reagent. The separation efficiency （Rs>2.5）， determination sensitivity （LOD=1 fmol） of acidic amino acids enantiomers were higher than those of existing methods， and an online confirmation of the enantiomers amounts was also achieved using this system. The recoveries were around 97104%， RSD values for intraday and interday precision were less than 5% for the acidic amino acids enantiomers in the biological samples. Furthermore， by analyzing the aging model senescence accelerated mouse prone 1 （SAMP1） mice which have low immunocompetence， the amounts of Daspartic acid in thymus and spleen were determined as （206±18） and （264±21） nmol/g， respectively. It is the first time that an obvious trend of the increasement of Daspartic acid （p<0.01） was observed in thymus and spleen of SAMP1 mice compare to senescence accelerated mouse resistant 1 （SAMR1） mice.

Keywords DAcidic amino acids； Enantiomers； Fullautomated； Twodimensional high performance liquid chromatography； Senescence accelerated mouse prone 1

（Received 3 January 2014； accepted 6 March 2014）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 81202499）