β—catenin在原发性肝细胞癌中的表达及其临床意义

王敏++++++朴金松++++++高蔚樱++++++郑一玮++++++谭小军

[摘要] 目的 探讨肝细胞癌肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）β-catenin的表达与HCC临床病理特征的关系。方法 应用Envsion法检测333例HCC，168例癌旁肝组织及89例正常肝组织的β-catenin表达；RT-PCR检测37例HCC及癌旁组织，肝癌细胞株HepG2和正常肝细胞株LO2的β-catenin mRNA表达。结果 β-catenin在HCC胞质、胞核的阳性表达率为79%/37%；在癌旁和正常肝组织中的表达率为72%/0%、70%/0%。差异均有统计学意义（P均<0.05）。且分化好的癌细胞表达低，分化差的细胞表达高。同时，HCC和HepG2的β-catenin mRNA表达高于癌旁组织及LO2的表达。结论 肝细胞癌的β-catenin过表达提示其在癌的发生过程中可能起着促癌的作用。

[关键词] β-catenin；肝细胞癌；组织芯片；免疫组织化学；RT-PCR

[中图分类号] R735.7 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）13-0031-04

Wnt/β-catenin信号途径调节控制着许多生命过程，包括生物体的生长、发育、疾病、衰老与死亡等。同时，Wnt/β-catenin信号途径也与肿瘤的发生密切相关，有十几种目前已知的高发性癌变源于Wnt/β-catenin信号转导途径的失调[1]。β-catenin是Wnt信号途径中具转录调控活性的关键成员，β-catenin能在细胞核内与Wnt途径的另一类成员LEF1/TCFs 结合从而激活靶基因的转录。β-catenin在正常成体细胞胞浆内含量少，而在肿瘤中常出现胞浆内累积和核内表达。因此，本研究拟通过检测β-catenin在大样本肝细胞癌病例中的表达，并对其阳性表达与肝细胞癌的临床病理特征进行分析，探讨其在肝细胞癌发生和发展中的作用，以期进一步阐明肝细胞癌的发病机制。

1 材料与方法

1.1 材料

石蜡标本：收集广州医科大学附属肿瘤医院病理科1998年1月～2008年1月明确诊断的肝细胞癌标本333例、癌旁肝组织168例及正常肝组织89例。每例患者均登记临床病理资料，包括年龄、性别、癌灶大小、HBs-Ag 状态、有无门静脉癌栓形成、血清AFP水平，肿瘤分级情况、TMN分期。

组织标本与细胞株：收集广州医科大学附属肿瘤医院2010年～2011年外科手术切除的新鲜肝细胞癌组织及其对应的癌旁非肿瘤组织共37例，其中男32例，女5例，年龄25～73岁，平均50.1岁。肝细胞癌细胞株HepG2，肝正常细胞株LO2均为广州医科大学肿瘤研究所保存。

1.2 主要试剂

β-catenin抗体（鼠抗人单克隆抗体，美国Transduction laboratories，clone 14），EnvisionTM试剂盒（K5007）购自DAKO公司；TRIzol Reagent（美国invitrogen），RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（美国MBI）。

1.3 方法

采用免疫组化Envision法及RT-PCR法进行检测，具体实验步骤参照试剂盒说明进行。

1.4 结果判断

染色结果判断：β-catenin阳性染色部位为胞膜、胞质和胞核。评分标准采用综合阳性细胞所占百分比和着色强度进行判断[2]。阳性细胞着色程度按轻、中及重度染色分别计为1、2、3分。阳性细胞所占百分比积分如下：0分为阳性细胞比例<5%，1分为6%～25%，2分为26%～50%，3分为51%～75%，4分为>76%。然后根据两项评分乘积判断结果。

RNA结果分析：采用图像分析软件Gensnap对电泳结果进行半定量分析，计算目的基因和内参基因的灰度比值。

1.5 统计学分析

所有数据均采用SPSS 15.0统计学软件包进行处理。采用χ2检验或Fisher精确检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 β-catenin蛋白的表达

β-catenin蛋白在胞膜的阳性表达率是70%（234/333）；在癌旁和正常肝组织的表达率分别是60%（100/168）和65%（58/89）。β-catenin在非癌组织中的膜表达低于在癌组织中的膜表达（封三图4A、C、D）。经统计学分析，肝细胞癌中β-catenin膜的表达与在非肿瘤组织中膜的表达两两比较有显著性差异（癌旁，P=0.000；正常肝组织，P=0.000）； β-catenin胞质的阳性表达率是79%（262/333）；在癌旁和正常肝组织中的表达率分别是72%（122/168）和70%（62/89）。β-catenin在非癌组织中的胞质表达低于在癌组织中的表达（封三图4A、C、D）。经统计学分析，肝细胞癌中β-catenin胞质的表达与在非肿瘤组织中胞质的表达两两比较有显著性差异（癌旁，P=0.000； 正常肝组织，P=0.000）； β-catenin蛋白在胞核的阳性表达率是37%（123/333），在非癌组织中无核表达（封三图4B）。经统计学分析，肝细胞癌中β-catenin胞核表达与在非肿瘤组织中核表达两两比较有显著性差异（癌旁，P=0.000； 正常肝组织，P=0.000）。

2.2 β-catenin mRNA的表达

本实验检测了37例肝细胞癌及对应的癌旁非肿瘤组织中β-catenin mRNA的表达。β-catenin mRNA在癌旁非肿瘤组织的表达明显低于其在肝细胞癌组织中的表达（图1）。经统计学分析，β-catenin mRNA在肝细胞癌组织和癌旁非肿瘤组织中的表达量有显著性差异（P=0.001）。本实验也检测了β-catenin mRNA在肝癌细胞株HepG2和正常肝细胞株LO2的表达。β-catenin mRNA在HepG2的表达明显高于其在LO2的表达（图1）。

A：肝细胞癌（T）及对应的癌旁非肿瘤组织（P）中β-catenin mRNA的表达；B：1.正常肝细胞株LO2中未检测出β-catenin mRNA的表达；2.肝细胞癌细胞株HepG2中β-catenin mRNA 过表达

图1 β-catenin mRNA的表达

2.3 β-catenin蛋白的表达与肝细胞癌临床病理参数的关系

β-catenin胞质表达与肿瘤细胞分化密切相关（P=0.031），随着细胞的分化程度降低而增加。与年龄、性别、AFP值、肿瘤大小、HBs-Ag 感染、门静脉癌栓和TNM分期无统计学意义。β-catenin蛋白核表达与HBV 感染密切相关（强度，P=0.028；百分比，P=0.026），与细胞分化程度相关（P=0.023），β-catenin蛋白核表达随着细胞分化程度的降低而增加。与年龄、性别、AFP值、肿瘤大小、门静脉癌栓和TNM分期比较，差异无统计学意义（表1）。

3 讨论

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率地区差异很大，常见于亚洲和非洲国家。HCC的发生是一个多阶段、多因素协同作用，经过启动、促癌和演进等多步骤过程以及多个癌基因和相关基因参与、多个基因发生突变的结果。有研究显示，β-catenin基因外显子3突变在肝癌中是频发事件，可达62.5%，其突变可使β-catenin稳定化，促进肝癌的发生[3]。

正常情况下β-catenin主要与细胞膜上E-cadherin结合参与细胞黏附作用，细胞内的β-catenin与糖原合成酶激酶3（GSK-3），结直肠腺瘤息肉蛋白（APC）和轴蛋白（Axin）结合，形成多聚蛋白复合体。并在APC和GSK-3β等作用下很快降解，不会形成聚集。当Wnt蛋白与胞膜受体结合后抑制GSK-3激活，阻止β-catenin多聚蛋白复合体的形成，β-catenin降解减少从而进入细胞核内形成β-catenin-Tcf/Lef复合体，调控下游靶基因的表达，参与肿瘤的发生发展。如乳腺癌、食管癌、结直肠癌、恶性黑色素瘤、白血病、前列腺癌、子宫内膜癌、原发性肝癌、甲状腺癌、胰腺癌等恶性肿瘤中都有Wnt/β-catenin通路异常[4]。

Lai等[5]研究结果显示β-catenin mRNA在肝细胞癌中的表达明显高于癌旁肝组织，免疫组化结果亦显示β-catenin异常累积出现在肝细胞癌细胞胞核中； Austinat等[6]的研究显示，在53例肝细胞癌标本中有42例呈胞质/胞核阳性表达；Inagawa的研究亦表明[7]β-catenin 在肝癌中呈局部或广泛核内表达，其核阳性表达率达35.3%，在癌旁非肿瘤组织中无胞核表达。Higgs MR等[8]的研究显示HCV型肝炎病毒诱导活化的β-catenin促进c-Myc基因的表达，表明β-catenin与HCV相关肝细胞癌的发生发展中起着重要的作用。Evason KJ等[9]研究发现β-catenin在非典型肝细胞腺瘤样肿瘤与高分化肝细胞癌中的激活都有相似的形态学和细胞遗传学的改变，提示β-catenin在肝细胞癌发生的早期发生改变。本实验结果显示，β-catenin在癌旁肝组织和正常肝组织中中主要聚集在肝细胞膜，在大样本肝细胞癌组织中β-catenin胞质/核表达明显升高，核表达阳性率为37%。RT-PCR结果显示β-catenin mRNA在癌组织表达高，在非肿瘤组织中表达低；在肝癌细胞株HepG2表达高，在正常肝细胞株LO2表达低。与王启明等[10]的研究结果一致，亦提示β-catenin的激活与肝细胞癌的发生发展密切关系。

HCC的众多临床病理参数都与其生物学行为或预后存在着一定的联系。徐兵等[11]研究发现，β-catenin的异位表达与肿瘤的分级密切相关。本研究结果显示，β-catenin胞质/核的表达与肿瘤细胞分化程度和HBs-Ag状态（status）显著相关；β-catenin在分化差的细胞质/核表达高，分化好的细胞质/核表达低。β-catenin作为Wnt/β-catenin通路的关键成员，对细胞的分化有重要影响。Witjes CD等[12]研究表明β-catenin蛋白在胞质和核内的积聚与肝细胞癌细胞分化相关，低分化细胞表达升高，高分化细胞中减低。因此，本研究结果提示β-catenin蛋白的异常积聚过程伴随着细胞分化程度的降低，参与了肝细胞癌的发生发展。

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（收稿日期：2013-11-06）

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（收稿日期：2013-11-06）