PARP-1、P-gp和LRP在肺腺癌中的表达和相关性研究

刘彭坤，郝吉庆

（安徽医科大学第一附属医院肿瘤内科，安徽 合肥 230022）

PARP-1、P-gp和LRP在肺腺癌中的表达和相关性研究

刘彭坤，郝吉庆

（安徽医科大学第一附属医院肿瘤内科，安徽 合肥 230022）

目的 探讨聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶-1（PARP-1）蛋白与 P糖蛋白（P-gp）、肺耐药相关蛋白（LRP）在肺腺癌中的表达和相关性。方法 采用免疫组化SP法检测61例肺腺癌组织和20例癌旁正常肺组织中 PARP-1、P-gp和 LRP的表达结果。结果 PARP-1、P-gp和LRP的阳性表达率分别为77.05%、50.82%、67.21%，与周围癌旁组织差异有显著性（P＜0.05）。LRP的表达与肺腺癌淋巴结转移密切相关（P＜0.05），P-gp、PARP-1与临床病理特征无明显相关（P＞0.05）。P-gp与 LRP、PARP-1与 LRP之间呈正相关（r分别为0.525、0.269，P＜0.05），P-gp与 PARP-1之间无明显相关性（r＝0.223，P＝0.084）。结论

P-gp、LRP和 PARP-1在肺腺癌中的表达有一定的相关性，联合检测三者可作为判断肺腺癌恶性程度的生物学指标。

肺腺癌；免疫组化；聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶-1；P-糖蛋白；肺耐药相关蛋白

肺癌是世界上对人类致死率较高的恶性肿瘤之一［1］。肺癌按组织学可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌（non-small-cell carcinoma，NSCLC），NSCLC又主要分为鳞癌、腺癌、大细胞癌等。其中肺腺癌较易发生于女性及不抽烟者，且对化疗、放疗敏感性均较差。目前对于晚期肺腺癌患者，顺铂为主的方案联合化疗是其主要治疗手段之一，但常常因为耐药问题的存在使其疗效不尽如人意。肺癌对化疗药物的耐药性是一个多因素参与的复杂过程，而且各种因素之间相互依赖、相互制约、相互调节。目前有关肺癌耐药机制研究较多的主要有 P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp），肺耐药相关蛋白（lung resistance-related protein，LRP），此外，聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶 ［poly（ADP ribose）polymerase，PARP］也与化疗耐药有一定的相关性［2］。目前，PARP-1与P-gp、LRP在肺腺癌组织中的表达及相关性关系尚未见报道。本研究采用免疫组化方法检测PARP-1、P-gp及 LRP在肺腺癌组织中的表达分析其相关性及与临床病理特点之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取安徽医科大学第一附属医院2007年1月—2010年12月间，有完整病例资料的肺腺癌患者61例。所有患者术前均未接受放疗和化疗，调出患者组织石蜡切片，选取癌旁正常肺组织切片20例作为对照。所有病例均依据病理学诊断（手术后病理）为肺腺癌。收集记录患者的一般资料（如性别、年龄），分化程度，临床病理分期及淋巴结转移等临床病理特征。

1.2 免疫组织化学法检测 PARP-1、P-gp及 LRP蛋白的表达 标本蜡块制备成 4 μm连续切片，贴于防滑脱载玻片上。按照免疫组化试剂盒上的操作步骤进行 SP法染色。切片常规脱蜡至水，双蒸水冲2×5 min，加过碘酸室温孵育 30 s～1 min，双蒸水冲2×5 min；3%pH 6.0柠檬酸盐缓冲液微波20 min抗原修复；PBS冲3×3 min；滴加正常封闭用山羊血清工作液10 min；倾去，勿洗，滴加一定比例的一抗，4℃过夜；37℃温箱孵育30 min，PBS冲3× 3 min；滴加二抗工作液，室温孵育 10 min；PBS冲 3 ×3 min；滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液，室温孵育10 min；PBS冲3×3 min；DAB显色，镜下控制显色时间；苏木素衬染，盐酸酒精分化，中性树胶封片。用已知阳性切片作为阳性对照，PBS缓冲液（0.01 mmol·L-1，pH 7.4）代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定 实验结果由3位病理科医师盲法阅片，进行结果评估。采用半定量法判断肺腺癌组织中PARP-1、P-gp及LRP的表达情况：PARP-1蛋白胞核或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性表达，P-gP和LRP蛋白胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性表达。每张切片在200倍普通光镜下随机选取5个视野，每个视野计数100个细胞。计算每个视野中的阳性细胞的平均百分率作为该切片阳性细胞的百分率。在此基础上，参照文献评分方法［3］，首先对染色强度进行评分：淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分；再按阳性细胞所占的百分率进行评分：阳性细胞＜25%为1分，25%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。将每一标本两项得分相乘得出总分，0～3分记为 -，4～8分记为+，9～12分记为 ++。

1.4 统计学分析 采用 χ2检验、四格表精确概率法和Spearman相关性分析进行统计，所有数据均在SPSS 19.0统计软件上处理。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PARP-1、P-gp、LRP在肺腺癌组织中的表达情况 肺腺癌组织中PARP-1的阳性表达率77.05%（47／61）高于癌旁组织 30%（6／20），差异有统计学意义（χ2＝14.741，P＜0.001）；P-gp在肺腺癌组织中的阳性表达率是50.82%（31／61），高于癌旁组织20%（4／20），差异有统计学意义（χ2＝5.830，P＝0.016）；癌组织中LRP的阳性表达率67.21%（41／61）高于癌旁组织25%（5／20），差异有统计学意义（χ2＝10.937，P＝0.001）。见图1～3及表1。

图1 P-gp在肺腺癌中的阳性表达（SP×200）

图2 LRP在肺腺癌中的阳性表达（SP×200）

图3 PARP-1在肺腺癌中的阳性表达（SP×200）

表1 肺腺癌和癌旁组织中PARP-1、P-gp和LRP的表达

2.2 PARP-1、P-gp和 LRP在肺腺癌中的表达与临床病理特征之间的关系 LRP蛋白表达与淋巴结转移密切相关（χ2＝12.634，P＜0.001）；其他病 理特征组中三者表达均无明显差异。见表2。

表2 PARP-1、P-gp和LRP表达与肺腺癌临床病理特征之间的关系

2.3 肺腺癌组织中 P-gp、PARP-1和 LRP之间表达的相关性 肺腺癌组织中P-gp与 LRP的表达呈正相关（r＝0.525，P＜0.001）；PARP-1与LRP的表达呈正相关（r＝0.269，P＝0.036）；PAR-1P与 P-gp的表达无明显相关性（r＝0.223，P＝0.084）。见表3～5。

表3 肺腺癌组织中 P-gp与 LRP表达之间的相关性

表4 肺腺癌组织中 PARP-1与 LRP表达之间的相关性

表5 肺腺癌组织中PARP-1与P-gp表达之间的相关性

3 讨论

肺癌是全球范围内病死率较高的恶性肿瘤之一，预后差。2008年在对全球 182个国家的 27种肿瘤的发病率和死亡率的统计中显示，最常见的恶性肿瘤为肺癌，161万，占总数的12.7%；因恶性肿瘤死亡的最常见的原因为肺癌，138万，占总数的18.2%［4］。其中化疗药物的失败是影响患者预后一个重要因素。肿瘤细胞对多种化疗药物产生交叉耐药性，称多药耐药，是造成肿瘤化疗失败的主要原因［5］。已 发现 的 参 与耐 药 的 转运 蛋 白 有PARP、P-gp和 LRP等。

国内外文献报道，PARP是存在于真核细胞中催化聚 ADP核糖化的细胞核酶，在 DNA损伤检测和修复、染色体重塑、有丝分裂器形成和细胞死亡中发挥重要作用，已知 PARP的过激活与许多疾病有关，尤其是PARP-1在DNA损伤修复过程中发挥重要作用，而这种 DNA损伤修复功能与肿瘤的发生、化疗耐药性等有一定的关系。现已发现 PARP蛋白家族包括18个成员，其中PARP-1是在 PARP蛋白家族中含量最丰富、最重要的一员。PARP-1通过碱基切除修复途径对 DNA单链损伤进行修复［6］。PARP-1被损伤的 DNA激活，裂解烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）+产生烟碱及ADP核糖，ADP核糖进一步形成聚腺苷二磷酸核糖（poly ADP-ribose，PAR），PAR与受体蛋白共价结合，受体蛋白包括PARP-1自身，组蛋白及一些其他DNA修复蛋白等。当 PARP经ADP核糖聚合物自身修饰后，能从DNA断裂处解离，之后聚合物与DNA缺口相黏附。这些带大量负电荷的聚合物能招募一些在 BER-SSBs途径中发挥重要作用的蛋白如 XRCC1，其它一些参与染色体空间结构形成、DNA修复及复制的蛋白，亦能与PAR非共价结合，共同发挥对 DNA损伤修复作用。新近研究发现PARP在DNA损伤修复中还有更多功能，如能招募 MRE11、ATM；能够通过抑制 E2F4和 P130复合物而影响 BRCA1和 RAD51的表达［7］；能够与双链 DNA损伤修复途径中非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）中的蛋白激酶复合物相互作用［8］。已经发现经烷化剂处理的细胞，再经PARP抑制剂处理或通过 RNA干扰技术抑制 PARP的表达，所导致的 SSBs损伤修复效果不同［9］。PARP-1活化后能够催化合成 PAR对细胞内众多蛋白质进行翻译后修饰，发挥其生物学功能。此外目前研究较多的 P-gp是由 MDR1基因编码的分子量为170 kDa的跨膜糖蛋白，是ABC转运蛋白（ATP结合膜转运蛋白）超家族的重要成员，可以利用 ATP供能，介导多种药物在细胞内外的转运，使化疗药物在肿瘤细胞内的浓度降低，从而产生MDR［10］。LRP是一种位于细胞质和核膜上的穹窿体蛋白，LRP介导肿瘤细胞产生 MDR（多药耐药）的主要机制是通过胞吐小泡的胞吐作用或者分子泵机制将细胞内的药物泵出胞外，降低细胞内的药物浓度［11］。

本研究发现，PARP-1、P-gp和 LRP在肺腺癌组织中的阳性表达率分别为77.05%、50.82%、67.21%，均显著高于癌旁组织（P＜0.05），提示从未接受放化疗的肺腺癌患者存在较高的原发性耐药。LRP的表达与淋巴结转移密切相关（P＜0.05），与其他病理特征无明显相关，该结论与国内李英杰［12］等用免疫组化法所做的 LRP在非小细胞肺癌中的表达与临床病理特征间的关系结论是一致的。同时 P-gp、PARP与临床病理特征无明显相关（P＞0.05），提示这3种蛋白均可引起肺腺癌患者耐药。相关性分析发现，P-gp与 LRP、PARP与LRP之间呈正相关（r分别为0.525、0.269，P＜0.05），说明PARP、P-gp和 LRP在肺癌耐药的过程中可能有一定的相互协同作用。

综上所述，由于PARP-1、P-gp和LRP蛋白在肺腺癌的表达特征及意义不同，因此，联合检测有助于综合判断病情、合理选择药物及评估预后。本研究发现 LRP与肺腺癌的淋巴结转移相关，P-gp与LRP、LRP与PARP在耐药过程中有相互协同作用，提示肺癌多药耐药的形成可能是多因子、多途径的复杂过程，并且可能存在其他因素参与或相互影响，具体机制还需要进一步的深入研究。深入探讨肺癌多药耐药发生的现象及机制对于肺癌患者化疗方案的制定及提高化疗疗效有一定的指导意义。

［1］ Karachaliou N，Mayo C，Costa C，et al.KRAS mutations in lung cancer［J］.Clin Lung Cancer，2013，14（3）：205-214.

［2］ Ganesan S.MYC，PARP1，and chemoresistance：BIN there，done that？［J］.Sci Signal，2011，4（166）：15.

［3］ Tormanen-Napankangas U，Soini Y，Kahlos K，et al.Expression of caspases-3，-6 and-8 and their relation to apoptosis in nonsmall cell lung carcinoma［J］.Int J Cancer，2001，93（2）：192-198.

［4］ Ferlay J，Shin HR，Bray F，et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008：GLOBOCAN 2008［J］.Int J Cancer，2010，127 （12）：2893-2917.

［5］ 窦红漫，程 平，吴赛青，等.多药耐药蛋白 P-gP，Topo-II与p53蛋白在胃癌组织中的表达及意义［J］.安徽医药，2010，14 （11）：1294-1296.

［6］ Rouleau M，Patel A，Hendzel MJ，et al.PARP inhibition：PARP1 and beyond［J］.Nat Rev Cancer，2010，10（4）：293-301.

［7］ Hegan DC，Lu Y，Stachelek GC，et al.Inhibition of poly（ADP-ribose）polymerase down-regulates BRCA1 and RAD51 in a pathway mediated by E2F4 and p130［J］.Proc Natl Acad Sci，2010，107（5）：2201-2206.

［8］ Patel AG，Sarkaria JN，Kaufmann SH.Nonhomologous end joining drives poly（ADP-ribose）polymerase（PARP）inhibitor lethality in homologous recombination-deficient cells［J］.Proc Natl Acad Sci，2011，108（8）：3406-3411.

［9］ Strom CE，Johansson F，Uhlen M，et al.Poly（ADP-ribose）polymerase（PARP）is not involved in base excision repair but PARP inhibition traps a single-strand intermediate［J］.Nucleic Acids Res，2011，39（8）：3166-3175.

［10］Kim EH，Min HY，Chung HJ，et al.Anti-proliferative activity and suppression of P-glycoprotein by（-）-antofine，a natural phenanthroindolizidine alkaloid，in paclitaxel-resistant human lung cancer cells［J］.Food Chem Toxicol，2012，50（3／4）：1060-1065.

［11］Wang J，Zhang J，Zhang L，et al.Expression of P-gp，MRP，LRP，GST-π and TopoIIα and intrinsic resistance in human lung cancer cell lines［J］.Oncol Rep，2011，26（5）：1081-1089.

［12］李英杰，于长海，张 文.COX-2与LRP在非小细胞肺癌中的表达与肺癌预后的关系［J］.临床肺科杂志，2010，15（12）：1797-1798.

The expression of PARP-1，P-gp，LRP and their correlation in lung adenocarcinoma

LIU Peng-kun，HAO Ji-qing
（The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022，China）

Objective To investigate the expression and correlation of PARP-1，P-gp and LRP in lung adenocarcinoma.Methods The expression of PARP-1，P-gp and LRP in 61 adenocarcinoma of lung tissues and 20 adjacent tissues was detected by immunohistochemical SP method.Results The positive expression rate of PARP-1，P-gp and LRP in patients with lung cancer were 77.05%，50.82% and 67.21%respectively.The expression of PARP-1，P-gp and LRP in lung adenocarcinoma was significantly different from that in adjacent tissues（P＜0.05）.The expression of LRP was only closely correlated with lymph node metastasis（P＜0.05）.While the expression of P-gp and PARP-1 was not correlated with the clinic pathological characteristics.LRP expression was positively correlated with PARP-1 and P-gp.There was no significant correlation between P-gp and PARP-1（r＝0.223，P＝0.084）.Conclusion The drug resistance in lung cancer patients is affected by various factors.THE expression of PARP-1，P-gp and LRP have some correlation in lung adenocarcinoma.The expression of LRP was closely related to lymph node metastasis.

lung adenocarcinoma；immunohistochemistry；PARP-1；P-gp；LRP

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.05.017

2013-11-19，

2014-01-15）

安徽省自然科学基金项目计划（No 1308085MH142）

刘彭坤，男，硕士研究生

郝吉庆，女，主任医师，硕士生导师，研究方向：肺癌的个体化治疗，E-mail：ayfy_hjq＠163.com